组织总RNA小量提取试剂盒的应用

背景^[1-6]

组织总RNA小量提取试剂盒用于动物组织，细胞，老鼠尾巴，石蜡包埋组织基因组DNA提取，硅胶膜纯化技术，限度去除蛋白质，多糖，脂类等杂质，纯度高，整个提取过程无需乙醇沉淀和酚/氯仿抽提。组织总RNA小量提取试剂盒可从多种细胞和组织中快速进行总RNA柱式纯化。小于20分钟的高质量RNA；从单一的提取物中纯化高达1,000微克的RNA；无害组织（酚/氯仿）提取液裂解。使用组织总RNA小量提取试剂盒分离获得的总RNA可用于需要高质量的总RNA的多种下游应用领域。

操作步骤：

1.将组织在液氮中磨碎成粉沫。每20~30mg组织加600ulBufferRL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇），组织样本少于20mg加350ulBufferRL。样品体积不超过BufferRL体积的十分之一。

2.样品充分裂解后，室温放置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。

3.12000rpm离心2~5min，取上清进行下步操作。

4.加入1倍体积（600ul或350ul）的70%乙醇（无RNase水配制），混匀。

5.将步骤4所得溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube2ml）的吸附柱（SpinColumnCR）中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

6.向吸附柱中加入350μlBufferRD，10000rpm离心15sec，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.配制DNaseI混合液：取52ulDEPC-H2O，向其中加入8ul10×DNaseIBuffer和20ulDNaseI（1U/ul），混匀，配制成终体积为80ul的DNaseI混合液。

8.向吸附柱中直接加入80ulDNaseI混合液，20~30℃孵育15min。

9.向吸附柱中加入350ulBufferRD，10000rpm离心15sec，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10.向吸附柱中加入500ulBufferRW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

11.重复步骤10。

12.12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

13.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入30~50ulDEPC-H2O，室温放置1min，12000rpm离心1min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

应用^[7][8]

可用于奶牛乳腺组织中miRNA表达谱研究以及与泌乳相关miRNA的鉴定：

miRNA是一类长约22个核苷酸(nt)的小分子非编码RNA,它能使nRNA降解或蛋白翻译抑制而起调控基因的作用,目前在生命活动的各个过程中都有相关niRNA的报道。奶牛乳腺泌乳是一个重要的生理过程,但是关于miRNA对其调控的研究却不多。本研究采用Solexa高通量测序技术获得奶牛乳腺泌乳期和非泌乳的niRNA序列,用基因芯片和real-time PCR方法分析泌乳期和非泌乳期miRNA的表达差异。

采用生物信息学技术预测这些miRNA可能的靶基因,构建以泌乳为中心的miRNA调控网络图。最后研究了miR-484通过己糖激酶对糖代谢过程的调控。主要研究结果如下：

1、奶牛乳腺组织中niRNA的高通量测序为了获得奶牛乳腺组织中的miRNA,分别构建奶牛泌乳期与非泌乳期乳腺组织RNA文库,用Solexa高通量测序技术分别测序,共获得15,089,573条与18,079,366条原始读数,过滤低质量、重复等序列后有11,964,909条与15,968,116条纯净序列用于后续分析。分析其长度分布,发现有超过一半的纯净序列在22nt,证明测序可靠。

2、奶牛乳腺组织miRNA的鉴定和特征分析本部分主要是对获得的测序序列进行整理、归类和分析,挖掘miRNA的特征。对得到的纯净序列进行比对分类,共发现有885条pre-miRNA编码921条成熟体niRNA,在这些成熟体中有884条是唯一序列。这些唯一序列中有283条已知miRNA,96条与其他物种同源的miRNA,还有505条新发现的miRNA是。同时还分析了885条pre-miRNA在牛基因组上的定位,共有800条pre-miRNA能与牛基因组比对上,其中230条pre-miRNA能组成55个基因簇。

3、泌乳期和非泌乳期奶牛乳腺中miRNA表达差异谱分析及功能预测本部分主要研究泌乳期和非泌乳期奶牛乳腺组织中miRNA表达差异,并对已知miRNA进行靶基因预测,最终构建调控网络。

参考文献

[1]MicroRNA expression patterns in the bovine mammary gland are affected by stage of lactation 1[J].M.Wang,S.Moisá,M.J.Khan,J.Wang,D.Bu,J.J.Loor.Journal of Dairy Science.2012(11)

[2]MicroRNA-143(miR-143)Regulates Cancer Glycolysis via Targeting Hexokinase 2 Gene[J].Rong Fang,Tian Xiao,Zhaoyuan Fang,Yihua Sun,Fei Li,Yijun Gao,Yan Feng,Li Li,Ye Wang,Xiaolong Liu,Haiquan Chen,Xin-Yuan Liu,Hongbin Ji.Journal of Biological Chemistry.2012(27)

[3]miR-214 Regulates Lactoferrin Expression and Pro-Apoptotic Function in Mammary Epithelial Cells1,2[J].Liao,Yalin,Du,Xiaogu,L?nnerdal,Bo.The Journal of Nutrition.2010(9)

[4]A MicroRNA Targeting Dicer for Metastasis Control[J].Graziano Martello,Antonio Rosato,Francesco Ferrari,Andrea Manfrin,Michelangelo Cordenonsi,Sirio Dupont,Elena Enzo,Vincenza Guzzardo,Maria Rondina,Thomas Spruce,Anna R.Parenti,Maria Grazia Daidone,Silvio Bicciato,Stefano Piccolo.Cell.2010(7)

[5]The miR-15/107 Group of MicroRNA Genes:Evolutionary Biology,Cellular Functions,and Roles in Human Diseases[J].John R.Finnerty,Wang-Xia Wang,Sébastien S.Hébert,Bernard R.Wilfred,Guogen Mao,Peter T.Nelson.Journal of Molecular Biology.2010(3)

[6]Cloning and analysis of fetal ovary microRNAs in cattle[J].Swamy K.Tripurani,Caide Xiao,Mohamed Salem,Jianbo Yao.Animal Reproduction Science.2010(1)

[7]microRNAs and EMT in Mammary Cells and Breast Cancer[J].Josephine A.Wright,Jennifer K.Richer,Gregory J.Goodall.Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia.2010(2)

[8]李真.奶牛乳腺组织中miRNA表达谱研究以及与泌乳相关miRNA的鉴定[D].浙江大学,2012.