大鼠冠状动脉内皮细胞的应用

背景^[1-4]

大鼠冠状动脉内皮细胞分离自冠状动脉组织；冠状动脉是供给心脏血液的动脉，起于主动脉根部，分左右两支，行于心脏表面。采用Schlesinger等的分类原则，将冠状动脉的分布分为三型：右优势型、均衡型、左优势型。左右冠状动脉是升主动脉的对分支。左冠状动脉为一短干，发自左主动脉窦，经肺动脉起始部和左心耳之间，沿冠状沟向左前方行后，立即分为前室间支和旋支。前室间支沿前室间沟下行，旋支绕过心尖切迹至心的膈面与右冠状动脉的后室间支相吻合。冠状动脉内皮细胞呈单层扁平分布，是一薄层的专门上皮细胞，它形成冠状动脉的内壁，是血管管腔内血液及其他血管壁（单层鳞状上皮）的接口。内皮细胞是沿着整个循环系统，由心脏直至最小的微血管。大鼠冠状动脉内皮细胞采用混合酶短暂消化后组织贴块、结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10^5cells/瓶；细胞经CD31/vWF免疫荧光鉴定，纯度可达80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 

大鼠冠状动脉内皮细胞传代培养

1吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；

3用吸管轻轻吹打混匀，按1:2-1:3适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4待细胞完全贴壁后，培养观察；之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

注意事项^[5]

1.培养基于4℃条件下可保存3-6个月。

2.在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

3.传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。

应用^[6-8]

用于微环境对心血管系统疾病发生的影响机制研究

微环境改变对心血管系统疾病的影响,确定在高糖环境下O2-的生成部位;研究O2-对Kv通道功能的影响;揭示微环境改变（缺血、缺氧、pH值改变）及外界物质对心肌细胞Ito的作用机制。应用化学毒物STZ建立稳定糖尿病动物模型和的组织细胞培养模型;采用荧光成像技术、免疫组织化学技术确定在糖尿病微环境下大鼠冠状小动脉O2-生成部位;用离体小动脉灌流技术研究在高糖环境下冠状小动脉血管壁的舒缩功能及异丙肾上腺素、福斯克林和4-AP对小冠状动脉的影响;应用膜片钳技术研究在高糖环境下血管平滑肌细胞Kv通道功能的变化,结合Western-blot技术,研究高糖环境对Kv通道的影响;确立O2-与Kv通道的关系;应用电生理技术研究犬心肌细胞跨膜离子流Ito在微环境改变时的变化及各种外界物质如乌头碱、哇巴因等对Ito的影响,寻找调节微环境并使之保持稳态的物质。

高糖环境抑制了Kv开放,降低了Kv1.2和Kv1.5通道的蛋白表达,导致细胞膜去极化介导的血管舒张减弱,其作用与K+浓度、KATP通道、Ca2+通道及去内皮的环境无关,是由抑制cAMP信号系统引起的。氧自由基清除剂可明显改善糖尿病环境大鼠小冠状动脉的收缩功能,对冠状动脉血管平滑肌收缩与舒张有重要调节作用。心肌微环境改变对Ito的影响与心肌缺血、心律失常、心功不全有密切关系。在单细胞水平应用心脏毒素乌头碱和哇巴因可致心脏微环境改变,引起Ito的变化。化学物质RP58866和RP62719在较低浓度（1、10 mol·L-1）对Ito有明显的影响,其效价高于已知的同类化学物质,证明Ito的过度抑制可能是心脏保护剂致心律失常作用的一个因素。心脏保护剂青蒿素、环维黄杨星D及冬虫夏草水提液等对心室肌细胞Ito有影响,但作用较弱,说明在心脏微环境发生改变时这些保护剂有调节心室肌细胞Ito电流的作用。苦参碱对Ito无明显影响,但对心脏毒素乌头碱诱发的Ito改变确有干预作用,是一个有前途的调节微环境并使之保持稳态的物质。因此一个理想的微环境调节剂应该对氧自由基有清除作用、对Kv有调控作用、不应过度抑制或过度增加Ito。

参考文献

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[2]Diabetes Mellitus and its Chronic Complications[J].Barbara K.Bailes.AORN Journal.2002(2)

[3]Reactive oxygen species as mediators of organ dysfunction caused by sepsis,acute respiratory distress syndrome,or hemorrhagic shock:potential benefits of resuscitation with Ringer?s ethyl pyruvate solution[J].Mitchell P.Fink.Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care.2002(2)

[4]Adrenergic modulation of potassium currents in isolated human atrial myocytes[J].Ming-Jai Su,Jo-Feng Chi,Shu-Hsun Chu.Journal of Biomedical Science.1994(3)

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[6]A Life Course Approach to Chronic Disease pidemiology.Kuh D,Ben-Shlomo Y..1997

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[8]杜智敏.微环境对心血管系统疾病发生的影响机制研究[D].哈尔滨工业大学,2007.