大鼠心肌成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠心肌成纤维细胞分离自心脏组织；心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成，非心肌细胞占细胞总数的70%，其中90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。刚分离的心肌成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。

生理功能^[4-6]

近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能；心肌成纤维细胞主要功能为对心肌细胞起结构支持作用并负责细胞基质外的合成，当心肌损伤时能产生旁分泌生长因子。心肌成纤维细胞是心脏结缔组织中最常见的细胞，可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质，并且在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。因此，对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。 

大鼠心肌成纤维细胞采用胶原酶-胰蛋白酶联合消化结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10^5cells/瓶；细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

应用^[7][8]

用于RXRα通过TGF-β/Smads信号通路对急性心梗大鼠心肌重塑及心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的调控。

通过动物实验观察RXRa激动剂Bex(Bexarotene,Bex)对急性心梗大鼠心脏结构、功能变化的干预及梗死区心肌组织TGF-β1/Smad2、RXRa水平和胶原沉积的影响,细胞实验观察RXRa激动剂9-cis-RA(9-cis-retinoid acid)对TGF-β1缺氧条件下诱导大鼠心肌成纤维细胞Smad2信号蛋白磷酸化及心肌胶原Ⅰ、Ⅲ合成的作用,探讨RXRa对急性心梗后心肌重塑及心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的可能调控机制。

方法:动物实验:通过结扎冠状动脉左前降支制备SD大鼠急性心肌梗死模型。存活大鼠随机分为4组:1)A组,对照组,不行任何处理(n=8);2)B组,假手术组(n=8);3)C组,心梗组(n=8);4)D组,心梗-Bex组,心梗后以Bex(10mg/kg/d)治疗(n=8)。心脏彩超测定大鼠收缩末期左室前壁及后壁厚度、左室收缩末期及舒张末期内径,读取射血分数;左心导管法测定大鼠血流动力学指标;称重法测定大鼠左室质量,计算左室质量指数(左室质量/体质量);HE及天狼星红染色观察大鼠心肌组织的结构改变、胶原分布及含量;ELISA法测血清及心肌组织TGF-β1水平;Real-Time PCR测心肌组织RXRam RNA表达;免疫印迹法(Western-blotting)测心肌组织RXRa、Smad2、P-Smad2水平。

细胞实验:心肌组织块干涸法培养大鼠心肌成纤维细胞;免疫细胞化学及免疫荧光法进行心肌成纤维细胞鉴定;持续通氮气法建立心肌成纤维细胞缺氧环境,评价RXRa激动剂9-cis-RA和TGF-β1对心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响;Brd U掺入法测细胞增殖水平;MTT法测细胞代谢活性;ELISA法测细胞上清液胶原水平;Real-Time PCR技术测心肌成纤维细胞RXRa m RNA表达水平;Western-blotting检测RXRa、Smad2及P-Smad2水平;通过转染Si RNA(small interfering RNA,Si RNA)降低RXRa表达以及转染质粒DNA载体过表达RXRa,观察RXRa介导Smad2、P-Smad2水平在胞浆及胞核中的变化及对心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。

参考文献

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[2]2014 AHA/ACC Guideline for the Management of Patients With Valvular Heart Disease:A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines[J].Rick A.Nishimura,Catherine M.Otto,Robert O.Bonow,Blase A.Carabello,John P.Erwin,Robert A.Guyton,Patrick T.O’Gara,Carlos E.Ruiz,Nikolaos J.Skubas,Paul Sorajja,Thoralf M.Sundt,James D.Thomas.Circulation.2014(23)

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[4]Retinoid and TGF-βFamilies:Crosstalk in Development,Neoplasia,Immunity,and Tissue Repair[J].Qihe Xu,Jeffrey B.Kopp.Seminars in Nephrology.2012(3)

[5]Ski inhibits TGF‐β/phospho‐Smad3 signaling and accelerates hypertrophic differentiation in chondrocytes[J].Kyung‐OkKim,Erik R.Sampson,Robert D.Maynard,Regis J.O’Keefe,DiChen,HichamDrissi,Randy N.Rosier,Matthew J.Hilton,Michael J.Zuscik.J.Cell.Biochem..2012(6)

[6]TGF-βsignaling in fibrosis[J].Anna Biernacka,Marcin Dobaczewski,Nikolaos G.Frangogiannis.Growth Factors.2011(5)

[7]Smad2 and Smad3 as mediators of the response of adventitial fibroblastsinduced by transforming growth factorβ1[J].Min Ren,Bo Wang,Jidong Zhang,Ping Liu,Yijing Lv,Guilin Liu,Hong Jiang,Fenye Liu.Molecular Medicine Reports.2011(3)

[8]徐军霞.RXRα通过TGF-β/Smads信号通路对急性心梗大鼠心肌重塑及心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的调控[D].福建医科大学,2015.