EHA105感受态细胞的应用

背景^[1-6]

EHA105感受态细胞由EHA105菌株改造而来，为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA105(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。

pEHA105(pTiBo542DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：strep，赋予EHA105菌株链霉素抗性，适用于水稻、烟草等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率可达104cfu/μg。

农杆菌感受态细胞(EHA105 Competent Cell)操作步骤:

1.获得目的基因、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），循环获得所需基因片段。通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA链，以逆转录产物为模板进行循环获得产物。

2.构建重组表达载体EHA105农杆菌感受态细胞(EHA105 Competent Cell)载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收或冻融法回收载体大片段。产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

3.获得含重组表达质粒的表达菌种将连接产物转化大肠杆菌，根据重组载体的标志（抗蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

4.诱导表达EHA105农杆菌感受态细胞(EHA105 Competent Cell)挑取含重组质粒的菌体单斑至（含Amp50中37℃过夜培养。2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中,37℃震荡培养。

应用^[7][8]

EHA105感受态细胞可用于根癌农杆菌介导外源抗菌肽基因转化鱼腥草的研究：

抗菌肽(antimicrobial peptides,AP)是一类小分子的阳离子抗菌活性肽,对细菌有很强的杀伤作用,某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用,甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。其独特的作用机理,广谱抗微生物活性,被誉为天然抗生素。目前已有将抗菌肽基因转入到烟草、水稻、林木、蔬菜、果树、和中草药等植物中的报道。

鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb)为三白草科蕺菜属植物蕺菜的全草。具清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功能。用于痰热喘咳、热痢、热淋、痈肿疮毒等症。人工栽培后,由于其生长环境发生改变,抗病虫害能力有所降低,病虫害发生普遍且较严重,直接影响了鱼腥草的质量和产量。将外源抗菌肽基因转入鱼腥草中可以提高其抗病虫害的能力,增强其抗菌活性。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒(Tumor inducing plasmid)转化系统是目前研究得最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化系统之一。本实验应用根癌农杆菌介导法,将外源抗菌肽基因Cecropin B和NP-1融合基因转化到鱼腥草中。并摸索了二种不同根癌农杆菌EHA105与LBA4404转化鱼腥的条件。

参考文献

[1]A high throughput Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method for functional genomics of perennial ryegrass(Lolium perenne L.)[J].Shivendra Bajaj,Yidong Ran,Jonathan Phillips,Gunaseelan Kularajathevan,Sunil Pal,Dan Cohen,Kieran Elborough,Sathish Puthigae.Plant Cell Reports.2006(7)

[2]Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of blueberry(Vaccinium corymbosum L.)[J].Guo-Qing Song,K.C.Sink.Plant Cell Reports.2004(7)

[3]Role of bacterial virulence proteins in Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus awamori[J].C.B.Michielse,A.F.J.Ram,P.J.J.Hooykaas,C.A.M.J.J.van den Hondel.Fungal Genetics and Biology.2004(5)

[4]Agrobacterium-mediated transformation in the high-value medicinal plant Echinacea purpurea[J].Hsin-Mei Wang,Kin-Ying To.Plant Science.2004(4)

[5]Agrobacterium–mediated transformation and stable expression of the green fluorescent protein in Brassica rapa[J].Tony Wahlroos,Petri Susi,Lidia Tylkina,Svetlana Malyshenko,Svetlana Zvereva,Timo Korpela.Plant Physiology and Biochemistry.2003(9)

[6]Moxalactam as a counter-selection antibiotic for Agrobacterium-mediated transformation and its positive effects on Theobroma cacao somatic embryogenesis[J].Gabriela Antúnez de Mayolo,Siela N.Maximova,Sharon Pishak,Mark J.Guiltinan.Plant Science.2003(4)

[7]Acetosyringone and osmoprotectants like betaine or proline synergistically enhance Agrobacterium-mediated transformation of apple[J].David J.James,Sandra Uratsu,Jiasheng Cheng,Paola Negri,Peter Viss,Abhaya M.Dandekar.Plant Cell Reports.1993(10)

[8]来慧丽.根癌农杆菌介导外源抗菌肽基因转化鱼腥草的研究[D].广州中医药大学,2008.