人中性粒细胞透明质酸酶(NH)ELISA试剂盒

背景^[1-6]

人中性粒细胞透明质酸酶(NH)ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

中性粒细胞（neutrophil）是在瑞氏（Wright）染色血涂片中，胞质呈无色或极浅的淡红色，有许多弥散分布的细小的（0.2～0.4微米）浅红或浅紫色的特有颗粒。细胞核呈杆状或2～5分叶状，叶与叶间有细丝相连。中性粒细胞具趋化作用、吞噬作用和杀菌作用。

中性粒细胞来源于骨髓，具有分叶形或杆状的核，胞浆内含有大量既不嗜碱也不嗜酸的中性细颗粒。这些颗粒多是溶酶体，内含髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等丰富的酶类，与细胞的吞噬和消化功能有关。透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称，一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。

人中性粒细胞透明质酸酶是一种能水解透明质酸的酶(透明质酸为组织基质中具有限制水分及其它细胞外物质扩散作用的成分)，用于人体能暂时降低细胞间质的粘性，可促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收，为一种重要的药物扩散剂。临床用作药物渗透剂，促进药物的吸收，促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。

应用^[7][8]

人中性粒细胞透明质酸酶(NH)ELISA试剂盒可用于透明质酸酶的表达及酶法制备低聚透明质酸的研究：

透明质酸(hyaluronic acid)是一种酸性粘多糖,不同分子量的透明质酸展现出不同的生物学活性。透明质酸酶(hyaluronidase)是能催化高分子量透明质酸降解产生低分子量透明质酸的一类酶的总称。微生物来源的透明质酸酶又称为透明质酸裂解酶。利用生物技术手段重组表达微生物来源的透明质酸裂解酶具有独到的优点,既克服了动物透明质酸酶来源有限且异源表达困难的缺点,又解决了传统物理方法很难制备分子量小于10 kDa的HA且破坏HA化学结构的缺点,成为工业化制备低聚合度透明酸新的研究方向。

本论文以兽疫链球菌透明质酸酶Hy1B为研究对象,研究结果如下:(1)透明质酸裂解酶的表达。扩增基因组中一个透明质酸裂解酶基因hylb的部分片段(2208 bp),该片段包含hylb的完整功能域,编码的蛋白约83 kDa,并构建重组表达载体pET28a-hylb,在大肠杆菌E.coli/BL21(DE3)中高效表达。优化诱导条件后发现,0.1 mM的IPTG、20℃下,酶的表达量较高且为可溶性蛋白。重组蛋白经Ni柱梯度洗脱纯化后获得重组蛋白HylB,以透明质酸作为底物进行酶学性质分析。

结果显示,酶的最适反应温度为37℃,最适pH为6.5,Ca2+和Mg2+能提高酶活,在最适反应条件下透明质酸酶酶活可达4655 U/mg,37℃下酶的半衰期为2.4 h。(2)酶法制备低分子量透明质酸。用该酶催化降解透明质酸,通过计算酶的用量和反应时间的关系,成功制备从1X 106 Da～6×103 Da分子量不等的低分子量透明质酸,并随着反应时间延长或酶量增加可制备更低分子量透明质酸寡糖。琼脂糖凝胶电泳显示酶解后的透明质酸分子量迅速降低。

紫外光谱扫描降解后的产物,结果发现酶解产物会在232nm处出现吸收峰,这与β-l,4糖苷键断裂得到4,5-不饱C=C双键一致。傅里叶变换红外光谱扫描酶解产物,结果显示酶解产物与对照组样品结构一致,这说明酶解并未破坏透明质酸化学结构。(3)酶法制备透明质酸寡糖。增加酶的用量,并延长酶促反应时间,来使底物透明质酸完全降解,制备终产物不饱和二糖。将反应完全的底物稀释后用截留分子量为600 Da的聚砜膜超滤,得到的样品经液相质谱鉴定为较纯的二糖。比较并分析了几种常见的凝胶填料对透明质酸寡糖的分离效果,为制备其它其它分子量的寡糖提供了参考。

参考文献

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