RH-35(RH35)大鼠肝癌细胞

背景^[1-7]

RH-35(RH35)大鼠肝癌细胞源自由N-2feuorenyldiuctamid在雄性AxC大羸中诱导的可移植Reulier H-35肝癌.细胞较小,提供者称饥饿24小时可以使其同步。培养及冻存条件培养基：90%高糖DMEM+10%FBS；血清：10%FBS(Diagnovum)；温度37℃。细胞观察及传代：显微镜观察细胞，当细胞融汇至80%左右（可以传代的情况下），细胞应该在37度培养箱预温1-2h后再做处理。如未达到细胞传代密度，培养瓶应预留一部分培养基继续培养。严格无菌操作，打开细胞培养瓶。

将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。用PBS 2-3ml/次轻轻洗细胞表面，加入适量的0.05%胰酶-EDTA消化细胞,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。1000rpm,5min离心，重悬细胞。换新的细胞培养瓶，37℃,5%CO2培养。空气条件5%CO2，95%AIR；冻存条件；培养基50%、血清40%、DMSO 10%。

冷冻保存方法一:冷冻管置于4度300分钟-(-20度30分钟)-80度16~18小时(或隔夜)一液氮槽长期储存,

冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3度至-80度以下,再放入液氮槽期储存.-20度不可超过1/小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,也可跳过此步骤直接放入-80度冰箱中,但存活率稍微降低一些。

应用^[8][9]

RH-35(RH35)大鼠肝癌细胞可用于大鼠肝癌细胞RH-35凋亡的研究：

利用人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）的高表达特性,根据ONC（AF332139.1）及HSA（NM000477.5）的基因序列,通过密码子优化及GC含量调整等方法设计并优化rONC及其融合蛋白rHSA-ONC的基因序列,并在融合蛋白间插入不同长度的以Gly4Ser1为模板进行重复的连接肽,得到了高表达的融合蛋白,简称rHSA-M（0,1,2,3）-ONC。

为了研究本实验室纯化的rONC和rHSA-M（0,1,2,3）-ONC对肝癌细胞的杀伤作用,本实验用不同浓度的rONC和rHSA-M（0,1,2,3）-ONC处理体外培养的大鼠肝癌细胞RH-35,通过磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B,SRB）比色法检测不同处理组RH-35细胞的增殖率;Hoechst染色法检测不同处理组RH-35细胞的活性;流式细胞术检测细胞周期时相的分布和凋亡率;qRT-PCR和Western Blot法检测细胞内BCL-2、BAX等基因和蛋白的表达变化;划痕法检测细胞迁移的情况。

结果发现rONC和rHSA-M（0,1,2,3）-ONC作用于RH-35细胞后,细胞抑制率与药物处理时间和浓度呈正相关（P<0.05）,rONC组细胞抑制率最高,rHSA-M0-ONC组的细胞抑制率最低;rONC组使细胞处于G0/G1期的比例较rHSA-M（0,1,2,3）-ONC组多,rONC组细胞凋亡率较rHSA-M（0,1,2,3）-ONC组明显增加,rHSA-M0-ONC组的细胞凋亡率最低;rONC组和rHSA-M（0,1,2,3）-ONC组均能使BCL-2表达下调,BAX表达上调;rONC组抑制细胞迁移的能力较rHSA-M（0,1,2,3）-ONC组高。

综上所述,rONC和rHSA-M（0,1,2,3）-ONC均能抑制RH-35细胞的增殖并且促进其凋亡,但对增殖的抑制作用和对凋亡的促进作用存在差异。其中rONC的活性最强,rHSA-M（0,1,2,3）-ONC的活性与连接肽长度有关,随着连接肽长度增加,融合蛋白对RH-35细胞增殖的抑制作用逐渐增强;rONC和rHSA-M（0,1,2,3）-ONC可通过上调BAX表达和下调BCL-2表达,从而促进大鼠肝癌细胞RH-35凋亡,抑制增殖,其凋亡机制可能与BCL-2、BAX表达变化相关。

豹蛙抗瘤酶（Onconase,ranpirnase,ONC）是一种天然的蛋白质,提取于北极豹蛙的卵母细胞和早期胚胎中,它有很强的杀伤力,在体内外的许多肿瘤试验中都得到了很好的体现,是个进入抗肿瘤临床试验的核糖核酸酶。目前,临床试验中所用的ONC均取自蛙卵和早期胚胎,其存在制备工艺复杂和获取困难等问题,难以满足临床需要。

参考文献

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