细菌基因组DNA提取试剂盒

背景^[1-6]

细菌基因组DNA提取试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌（革兰氏阳性菌和阴性菌）的基因组DNA。溶菌酶能有效去除细菌细胞壁；蛋白酶K能把核酸解离出来；RNaseA能去除痕量的RNA污染；离心吸附柱能够高效、专一吸附DNA，限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

细菌基因组DNA提取试剂盒用于细菌基因组DNA的小量提取。其纯化原理是利用细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，由硅胶膜柱可逆吸附基因组DNA，经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质等杂质后，用纯化液洗脱获得基因组DNA。本产品可从0.5-2 ml对数生长期的菌液（不超过106–108个）中提取到3-20μg超纯基因组DNA（OD260/280=1.7-1.9），此基因组DNA可直接用于酶切、PCR等后续实验。

操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1.取细菌培养液1–2 ml，10,000 g离心1分钟，尽量吸净上清；向细菌沉淀中加入180μl EB，旋涡混匀后加入18μl溶菌酶，室温放置10-15分钟，期间间歇混匀几次。

2.10,000g离心1分钟，吸弃大部分上清，留下约10μl液体，彻底混匀。

3.向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，混匀。

4.向管中加入20μl蛋白酶K，混匀，55℃处理15-30分钟，期间间歇混匀2-3次至溶液清亮。

5.加入10μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混匀后室温放置2分钟。

6.加入220μl缓冲液GB，混匀，70℃放置10-30分钟（对于革兰氏阳性菌，时间应延长到60分钟）。

7.加入220μl无水乙醇，充分混匀。

8.将上一步所得溶液和絮状沉淀加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），11,000g离心5分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

9.向吸附柱CG中加入500μl去蛋白液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11,000 g离心2分钟，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

10.向吸附柱CG中加入700μl漂洗液GW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11,000 g离心60秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

11.向吸附柱CG中加入500μl漂洗液GW，11,000 g离心60秒，倒掉废液。

12.吸附柱CG放回收集管中，11,000 g离心2分钟。

13.将吸附柱CG转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50–100μl经70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，11,000 g离心2分钟。

14.DNA产物-20℃保存。

应用^[7][8]

细菌基因组DNA提取试剂盒可用于细菌基因组DNA提取：

对虾肠道中存在大量的微生物群落,它们对宿主的营养、生理、免疫和疾病防御起着重要的作用。近来微生态制剂开始用于对虾养殖中以促进其生长、提高免疫力和减少病害发生。水产微生态制剂作为抗生素的替代品,代表水产养殖病害防治当前和未来的发展方向,但是其被水产动物口服后的作用机理并不是十分清楚。了解对虾肠道微生物区系中微生物的组成、结构及其生理功能如何,在此基础上可以进一步研究外源有益微生物制剂对其影响,将有助于微生态制剂在水产养殖中的有效应用与推广。

应用PCR-DGGE法和16S rDNA文库法研究分析中国明对虾和日本囊对虾肠道微生物组成,鉴定其优势种群；比较分析芽孢杆菌和柠檬酸等对日本囊对虾肠道微生物的影响；比较分析水产常用抗生素氟苯尼考对日本囊对虾肠道微生物的影响,为养殖对虾肠道微生物区系的调控技术提供理论依据。

主要研究结果如下：1.健康成年中国明对虾肠道微生物样品经DGGE分离得到22个不同位置的条带,鉴定后分别属于变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)两大类群,分别为冷杆菌属,不动杆菌属,假单胞菌属,希万氏菌属,海洋螺菌属,弧菌属,Thalassobius属,肠球菌属：构建16S rRNA克隆文库,克隆子经测序比对后分别属于变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)两大类群,分别为肠杆菌属,弧菌属,希万氏菌属,亮发菌属,红细菌属,弓形杆菌属,Loktanella属,玫瑰杆菌属,黄杆菌属,不可培养细菌。

参考文献

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[2]Ecophysiology of the Developing Total Bacterial and Lactobacillus Communities in the Terminal Small Intestine of Weaning Piglets[J].Robert Pieper,Pawel Janczyk,Annette Zeyner,Hauke Smidt,Volker Guiard,Wolfgang Bernhard Souffrant.Microbial Ecology.2008(3)

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[6]Species-Specific Identification of Commercial Probiotic Strains[J].P.S.M.Yeung,M.E.Sanders,C.L.Kitts,R.Cano,P.S.Tong.Journal of Dairy Science.2002(5)

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[8]刘淮德.应用微生物分子生态学方法研究对虾肠道细菌组成及其变化规律[D].中国科学院研究生院（海洋研究所）,2010.