SAMHD1抗体的应用

背景^[1-3]

SAMHD1抗体是一种可以特异性结合PDX1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的PDX1蛋白。SAMHD1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

SAMHD1在单核细胞和单核细胞衍生的树突状细胞中高度表达，在单核细胞衍生的巨噬细胞中以较低程度高表达，据报道是一种HIV-1限制因子，可抑制HIV-1生命周期的早期步骤。Vpx（含有病毒蛋白X的病毒样颗粒）可以通过与SAMHD1相互作用来克服这一阻断，诱导SAMHD1的蛋白酶体依赖性降解。SAMHD1突变会导致Aicardi-Goutières综合征，这是一种推测具有免疫发病机制的遗传性脑病。已经描述了编码不同亚型的三种可变剪接转录本。

SAMHD1抗体

SAMHD1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（SAMHD1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(SAMHD1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

SAMHD1抗体可以用于SAMHD1单克隆抗体的制备及其初步应用

以受捐者单核细胞提取的RNA为模板，通过RT-PCR方法，扩增出SAMHD1基因，通过双酶切将其分别克隆至pcDNA3.1和pET30a载体中。通过对原核表达系统的优化，最终获得分子质量约79KDa、可溶性形式的重组蛋白SAMHD1，并采用镍柱对该蛋白进行纯化。SAMHD1抗体Western blot检测结果表明，原核及真核重组蛋白SAMHD1分别与His和HA抗体发生特异性反应，表明SAMHD1基因在原核和真核表达系统中均获得正确表达。

本研究利用原核表达并纯化的人SAMHD1蛋白为免疫原，经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，获得了1株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C3。其抗体亚型为IgG2b/κ链。Western blot实验结果表明3C3MAb不仅可以识别pcDNA-huSAMHD1转染293T细胞后大量表达的外源性SAMHD1，也可以识别293T、THP-1细胞内源性表达的少量SAMHD1蛋白。此单抗不与猴、马SAMHD1的真核表达蛋白反应，且与未转染的马皮细胞、驴皮细胞、兔肾细胞均无反应。表明制备的3C3MAb仅具有识别人SAMHD1的特点，而与其他种属的SAMHD1无交叉反应，具有良好的种属特异性。SAMHD1抗体单抗可用于免疫荧光、Western blot、ELISA等免疫学方法的检测。HD结构域是SAMHD1的主要功能区，为鉴别制备的3C3MAb针对的抗原表位是否也位于其HD区域，本实验成功构建了SAMHD1的两个功能区SAM、HD的原核表达质粒pET-SAMHD1-SAM和pET-SAMHD1-HD，分别将其转化至Rosetta(DE3)感受态细胞，进行IPTG诱导表达。两个重组蛋白的相对分子质量分别为26kDa和62kDa。Western blot结果表明3C3MAb只与SAMHD1的HD原核表达蛋白呈阳性反应，而与其SAM原核表达蛋白无反应，因此，3C3MAb针对的抗原表位位于HD区域内。

参考文献

[1]Single-stranded nucleic acids promote SAMHD1 complex formation[J].Victoria Tüngler;;Wolfgang Staroske;;Barbara Kind;;Manuela Dobrick;;Stefanie Kretschmer;;Franziska Schmidt;;Claudia Krug;;Mike Lorenz;;Osvaldo Chara;;Petra Schwille;;Min Ae Lee-Kirsch.Journal of Molecular Medicine,2013(6)

[2]Tight Interplay among SAMHD1 Protein Level,Cellular dNTP Levels,and HIV-1 Proviral DNA Synthesis Kinetics in Human Primary Monocyte-derived Macrophages[J].Baek Kim;;Laura A.Nguyen;;Waaqo Daddacha;;Joseph A.Hollenbaugh.Journal of Biological Chemistry,2012(26)

[3]Evolutionary and Functional Analyses of the Interaction between the Myeloid Restriction Factor SAMHD1 and the Lentiviral Vpx Protein[J].Nadine Laguette;;Nadia Rahm;;Bijan Sobhian;;Christine Chable-Bessia;;Jan Münch;;Joke Snoeck;;Daniel Sauter;;William M.Switzer;;Walid Heneine;;Frank Kirchhoff;;Frédéric Delsuc;;Amalio Telenti;;Monsef Benkirane.Cell Host&Microbe,2012(2)

[4]The Ability of Primate Lentiviruses to Degrade the Monocyte Restriction Factor SAMHD1 Preceded the Birth of the Viral Accessory Protein Vpx[J].Efrem S.Lim;;Oliver I.Fregoso;;Connor O.McCoy;;Frederick A.Matsen;;Harmit S.Malik;;Michael Emerman.Cell Host&Microbe,2012(2)

[5]戈曼.SAMHD1单克隆抗体的制备及其初步应用[D].东北农业大学,2013.