USP14抗体的应用

背景^[1-3]

USP14抗体是一种可以特异性结合PDX1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的PDX1蛋白。USP14抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

USP14（泛素羧基末端水解酶14）也称为TGT，属于肽酶C19家族。哺乳动物USP14在已知的UBP酶中是独一无二的，因为它在与26S蛋白酶体特异性结合时被催化激活。USP14抑制加速了氧化蛋白的降解并增强了对氧化应激的抵抗力。该蛋白质具有45 kDa催化结构域（PMID：16211010）。

USP14抗体

USP14抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（USP14抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(USP14抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

USP14抗体可以用于线粒体乙醛脱氢酶2通过调控巨噬细胞极化抑制动脉粥样硬化斑块的进展

ALDH2通过4-HNE调节cGAS去泛素化来调控cGAS-STING信号通路我们实验发现,ox-LDL刺激后内源性cGAS K48-linked泛素化水平降低,而ALDA-1显著增强了ox-LDL刺激后cGAS K48-linked泛素化;而daidzin对ALDH2的抑制进一步降低了ox-LDL刺激后的cGAS k48-linked的泛素化。已经证实,ALDH2代表性底物4-HNE水平的增加可以通过加合作用改变蛋白质翻译后修饰,并有助于AS的发生和发展。因此,我们推测4-HNE调控去泛素化酶裂解cGAS的K48-linked多泛素链,导致cGAS蛋白的稳定。通过Co-IP对可能参与调控cGAS k48-linked泛素化的去泛素化酶进行了筛选,发现内源性cGAS与USP14形成了一个复合物;并且这种相互作用在4-HNE刺激后增强了。

我们使用USP14抗体进行Co-IP,通过USP14抗体Western blot检测cGAS与USP14的结合情况,进一步证明了cGAS和USP14之间的内源性相互作用。为了验证USP14对4-HNE刺激后cGAS泛素化的影响,我们使用HEK293T细胞共转染了标记为Flag的cGAS、Myc标记的K48-Ub和HA标记的USP14质粒(野生型或突变体(C1 14A))。正如预期的那样,USP14(WT)过表达情况下,4-HNE刺激后cGAS K48-linked的泛素化水平明显下调,而USP14(C114A)则无上述泛素化水平的变化。我们接下来检测了USP14是否也介导了ALDH2/4-HNE对巨噬细胞极化的影响。Western blot分析显示,抑制USP14显著减弱了4-HNE或ALDH2下调对巨噬细胞M1型极化的促进作用。综上所述,这些数据表明4-HNE通过增强USP14-cGAS的相互作用,抑制了cGAS的K48多泛素化依赖的蛋白降解,稳定cGAS蛋白水平。Amlexanox可减轻ALDH2活性下调对HFD喂养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成和巨噬细胞极化的影响在ApoE-/-小鼠进行NC或HFD喂养,构建模型期间,小鼠每隔一天腹腔注射daidzin,给予或不给予Amlexanox,发现Amlexanox可显著抑制TBK1及其下游分子的活化,减少了HFD和daidzin联合作用下的动脉粥样硬化小鼠的斑块面积、降低了炎症因子水平,降低了M1型巨噬细胞标志物(CXCL-10和iNOS)的表达,增加了M2巨噬细胞标志物(Arg1)的表达。

参考文献

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[5]于华祥.线粒体乙醛脱氢酶2通过调控巨噬细胞极化抑制动脉粥样硬化斑块的进展[D].山东大学,2023.