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Protein G Agarose(Fast Flow,1ml)预装柱

发布日期:2020/3/4 7:04:13

背景[1-7]

Protein G Agarose(Fast Flow,1ml)预装柱是一种简便、快速、高效的用于抗体纯化、免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)或免疫共沉淀(Co-IP)的即用型预装柱,也称层析柱(Chromatography column)或纯化柱(Purification column)。也可用于实验中抗原抗体复合物的分离纯化。

天然蛋白A(Protein A)是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,天然蛋白G(Protein G)是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白,二者功能相似,主要通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc区相互作用,可结合大多数哺乳动物的IgG。然而两者结合特异性上有所不同,如蛋白G对人IgG3,大鼠IgG2a,绵羊IgG1具有很高的亲和力,但蛋白A对这些Ig结合力很弱。蛋白A,蛋白G常共价偶联在固体载体如琼脂糖珠或丙烯酸树脂小珠上,直接用以做免疫沉淀(IP)或者免疫共沉淀(Co-IP)来进行蛋白功能相关研究,或者直接装在层析柱上来纯化单克隆或者多克隆抗体。

Protein G Agarose(Fast Flow,1ml)预装柱使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G,不仅维持其本身的Ig亲和特性,同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本品同时将蛋白A和蛋白G共价偶联到琼脂糖凝胶微球表面,比单独的蛋白A或者蛋白G都有更广的结合范围,适合于所有蛋白A琼脂糖珠和蛋白G琼脂糖珠单独可以结合的Ig,实用性更高。

Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁表面蛋白,分子量为42kDa;Protein G是C型或G型链球菌(Streptococcal bacteria)表达的免疫球蛋白结合蛋白。Protein A和Protein G功能相似,能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)结合,结合的部位通常为免疫球蛋白的Fc区,但有资料显示Protein A也会和人VH3家族的Fab区结合,而Protein G有时与Fab区也有一定结合。同时,两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。适当重组改造的Protein A、G与琼脂糖凝胶(agarose)以一定的方式结合,可用于抗体的纯化.

应用[8][9]

Protein G Agarose(Fast Flow,1ml)预装柱可用于纯化human IgG1、IgG2、IgG4,mouse IgG2a、IgG2b及rabbit IgG等。

在免疫质谱检测肝癌患者血清多肽标志物的方法与应用研究中采用传统的单克隆抗体制备方法制备出2种多肽单克隆抗体:抗SP0104抗体、抗SP0105抗体,在此基础上使用Protein G Agarose建立了基于多肽抗体和MALDI-TOF-MS的免疫质谱方法,使用该方法对两种多肽标准品SP0104、SP0105进行检测,偏差小于0.5Da。

本文进一步优化了影响免疫质谱方法灵敏度和通量的条件,确定优化结果抗体/载体量比为3.9μg/μL,抗体与载体联接采用非交联方式、抗体孵育环境4℃旋转、抗体孵育时间15分钟、抗原孵育时间8小时、洗脱液含0.1%TFA的70%ACN、洗脱时间1分钟。通过优化以上影响抗体固定和抗原检测的关键因素,提高了免疫质谱方法检测通量及灵敏度。本文分别对所建立优化后的免疫质谱方法的线性范围、准确性、重复性、冻融稳定性进行方法评价,其中在0.1pmol~6.4pmol范围内线性关系良好,检测限0.1pmol,线性方程为I=601.5N-79.3,相关系数为0.9642。

我们分别将0.3pmol、0.9 pmol、2.7pmol标准品注入空白血清,回收率为117.6%、81.6%、125%,平行检测三次,RSD分别为26.3%、5.4%、25.6%。将0.9 pmol标准品注入空白血清,经三次冻融偏差幅度为7.3%~19.2%,显示3次冻融检测结果具有稳定性。

评价结果表明,优化后的免疫质谱方法适用于血清低浓度多肽的检测。最后我们比较了有机溶剂沉淀、超滤、去除IgG和白蛋白、解离白蛋白连接的多肽等4种血清多肽预处理方法和不处理对免疫质谱检测结果的影响,结果表明不处理时标志物检测值最高。采用通过优化的免疫质谱方法完成对20例正常血清、20例肝癌血清的检测,结果两组质谱峰强度检测值经过t检验,P<0.003,两组检测值具有显著性差异。结果表明免疫质谱方法可用于肝癌多肽血清标志物的诊断研究。

参考文献

[1]Epitope Structure of the Carbohydrate Recognition Domain of Asialoglycoprotein Receptor to a Monoclonal Antibody Revealed by High-Resolution Proteolytic Excision Mass Spectrometry[J].Raluca Stefanescu,Rita Born,Adrian Moise,Beat Ernst,Michael Przybylski.Journal of The American Society for Mass Spectrom.2011(1)

[2]Peptides Generated Ex Vivo from Serum Proteins by Tumor-Specific Exopeptidases Are Not Useful Biomarkers in Ovarian Cancer[J].Timms,John F,Cramer,Rainer,Camuzeaux,Stephane,Tiss,Ali,Smith,Celia,Burford,Brian,Nouretdinov,Ilia,Devetyarov,Dmitry,Gentry-Maharaj,Aleksandra,Ford,Jeremy,Luo,Zhiyuan,Gammerman,Alex,Menon,Usha,Jacobs,Ian.Clinical Chemistry.2010(2)

[3]Utility of Lens culinaris Agglutinin-Reactive Fraction ofα-Fetoprotein and Des-Gamma-Carboxy Prothrombin,Alone or in Combination,as Biomarkers for Hepatocellular Carcinoma[J].Richard K.Sterling,Lennox Jeffers,Fredric Gordon,Alan P.Venook,K.Rajender Reddy,Shinji Satomura,Futoshi Kanke,Myron E.Schwartz,Morris Sherman.Clinical Gastroenterology and Hepatology.2009(1)

[4]Diagnosis and Treatment of Hepatocellular Carcinoma[J].Hashem B.El-Serag,Jorge A.Marrero,Lenhard Rudolph,K.Rajender Reddy.Gastroenterology.2008(6)

[5]Preparing a highly specific inert immunomolecular-magnetic beads for rapid detection and separation of S.aureus and group G Streptococcus[J].Xiao Xiao,Xu Yang,Ting Liu,Zhang Chen,Lingli Chen,Huidong Li,Le Deng.Applied Microbiology and Biotechnology.2007(5)

[6]Clinical Evaluation of Lens Culinaris Agglutinin-Reactiveα-Fetoprotein and Des-γ-Carboxy Prothrombin in Histologically Proven Hepatocellular Carcinoma in the United States[J].Brian I.Carr,Futoshi Kanke,Margaret Wise,Shinji Satomura.Digestive Diseases and Sciences.2007(3)

[7]Improving the prediction of hepatocellular carcinoma in cirrhotic patients with an arterially‐enhancing liver mass[J].Jorge A.Marrero,Hero K.Hussain,Hahn V.Nghiem,Ramsey Umar,Robert J.Fontana,Anna S.Lok.Liver Transpl.2005(3)

[8]Hepatocellular carcinoma in cirrhosis:Incidence and risk factors[J].Giovanna Fattovich,Tommaso Stroffolini,Irene Zagni,Francesco Donato.Gastroenterology.2004(5)

[9]原剑.免疫质谱检测肝癌患者血清多肽标志物的方法与应用研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,2011.

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