WIF1抗体的应用

背景^[1-3]

WIF1抗体是一种可以特异性结合WIF1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的WIF1蛋白。WIF1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

WIF1基因编码的蛋白质起到抑制WNT蛋白的作用，WNT蛋白是在胚胎发育中发挥作用的细胞外信号分子。该蛋白质包含一个WNT抑制因子（WIF）结构域和五个表皮生长因子（EGF）样结构域，被认为参与中胚层分割。相关基因作为肿瘤抑制因子相关基因发挥作用，并且已发现在各种癌症中具有表观相关性遗传沉默。

WIF1抗体

WIF1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（WIF1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(WIF1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

WIF1抗体可以用于WIF1在非小细胞肺癌临床样本中的表达及其抑制肿瘤转移的作用机制研究

研究WNT抑制因子1(WNT inhibitory factor 1,WIF1)在非小细胞肺癌临床组织样本中的表达情况,分析WIF1表达与非小细胞肺癌转移的关系,在细胞水平研究WIF1对非小细胞肺癌细胞A549侵袭、迁移的影响,并探讨其可能的作用机制。

方法：搜集非小细胞肺癌患者临床组织样本(癌组织和癌旁组织),利用Real-time PCR、WIF1抗体Western blot检测临床样本中WIF1分别在m RNA和蛋白水平的表达情况,同时用TCGA公共数据库的数据进行生物信息学分析,辅助验证临床检测结果。分析WIF1 m RNA表达与临床病理、预后的关系。培养肺癌细胞A549,构建WIF1过表达质粒,过表达质粒和或空载质粒分别转染A549,划痕和transwell实验检测WIF1过表达对细胞侵袭、迁移的影响,Western blot检测MMP-2、MMP-9表达水平。Western blot检测β-catenin表达,验证WIF1对wnt/β-catenin信号通路的影响。结果在研究发现WIF1 m RNA和蛋白的表达在癌组织中显著低于癌旁组织(P<0.05)。同时TCGA共数据库的数据显示WIF1在肺腺癌和肺鳞癌中表达量均显著低于正常组(P<0.05)。肺癌患者中,WIF1抗体WIF1高表达组的淋巴结转移发生率和TNM分期都显著低于WIFI低表达的患者,且其生存期显著高于低表达组(P<0.05)。WIF1抗体过表达WIF1显著抑制A549细胞的迁移和侵袭能力,并显著下调肿瘤转移相关标志物MMP-2和MMP-9的表达(P<0.05)。过表达WIF1显著抑制了β-catenin和Myc蛋白表达(P<0.05)。

参考文献

[1]Wnt and Notch signaling govern self-renewal and differentiation in a subset of human glioblastoma stem cells.[J].Rajakulendran Nishani;;Rowland Katherine J;;Selvadurai Hayden J;;Ahmadi Moloud;;Park Nicole I;;Naumenko Sergey;;Dolma Sonam;;Ward Ryan J;;So Milly;;Lee Lilian;;MacLeod Graham;;Pasiliao Clarissa;;Brandon Caroline;;Clarke Ian D;;Cusimano Michael D;;Bernstein Mark;;Batada Nizar;;Angers Stephane;;Dirks Peter B.Genes&development.2019

[2]WIF-1 and Ihh Expression and Clinical Significance in Patients With Lung Squamous Cell Carcinoma and Adenocarcinoma.[J].Zhang Yue;;Hu Chunhong.Applied immunohistochemistry&molecular morphology:AIMM.2018

[3]Wnt inhibitory factor-1-mediated autophagy inhibits Wnt/β-catenin signaling by downregulating dishevelled-2 expression in non-small cell lung cancer cells.[J].Luo Xinmei;;Ye Sujuan;;Jiang Qianqian;;Gong Yi;;Yuan Yue;;Hu Xueting;;Su Xiaolan;;Zhu Wen.International journal of oncology.2018

[4]CAFET algorithm reveals Wnt/PCP signature in lung squamous cell carcinoma.[J].Yue Hu;;Anna V Galkin;;Chunlei Wu;;Venkateshwar Reddy;;Andrew I Su.PLoS ONE.2017

[5]刘嘉林.WIF1在非小细胞肺癌临床样本中的表达及其抑制肿瘤转移的作用机制研究[D].安徽医科大学,2021.