大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒是一种用于体外定量检测大鼠样本中膜联蛋白Ⅴ（ANX-Ⅴ）浓度的实验试剂盒。这些试剂盒主要用于科研目的，不适用于临床诊断。以下是关于大鼠膜联蛋白Ⅴ（ANX-Ⅴ）ELISA试剂盒的一些详细信息：

大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒检测原理：试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。具体来说，使用抗大鼠膜联蛋白Ⅴ抗体包被于酶标板上，样品中的大鼠膜联蛋白Ⅴ会与包被抗体结合。接着依次加入生物素化的抗大鼠膜联蛋白Ⅴ抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，形成免疫复合物。加入显色底物TMB后，在辣根过氧化物酶的催化下，TMB呈现蓝色，加终止液后变成黄色。最后，在450 nm波长处测量吸光度（OD值），通过绘制标准曲线计算出样品中大鼠膜联蛋白Ⅴ的浓度。

基本性能：

灵敏度：灵敏度为0.94 ng/mL。

检测范围：检测范围为1.56-100 ng/mL。

特异性：可检测样本中的大鼠膜联蛋白Ⅴ，且与其他类似物无明显交叉反应。

大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒组成：试剂盒通常包含预包被酶标板、标准品、稀释液、HRP标记抗体、显色底物、终止液等。

保存条件：试剂盒应在2-8°C保存，有效期标注于标签上（通常是6个月）。

样本类型：适用于血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清等生物液体。

大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒

使用大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒进行实验时，需要按照以下步骤进行：

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒可以用于ANX联合经血源性间充质干细胞对大鼠坐骨神经缺损的影响

探究ANX联合MenSCs对于SD大鼠坐骨神经缺损的影响。

方法1.用Percoll分层液分离培养原代MenSCs,CCK-8法检测P6代细胞的增殖情况,流式细胞术鉴定细胞表面标志物;2.化学萃取法制备新西兰大白兔胫神经来源的ANX,用HE染色后光镜观察ANX脱细胞情况;3.将P6代的MenSCs悬液用微量注射器注入ANX后共培养4d,透射电镜观察组织学情况,用免疫荧光法检测共培养体系分泌神经生长因子(NGF)和神经营养因子-3(NT3)的情况;4.制备SD大鼠右侧坐骨神经缺损模型,随机分为自体移植组、单纯ANX组和ANX+MenSCs共培养组,将不同组的支架移植到SD大鼠右侧坐骨神经缺损处;5.移植术后在4w和8w两个不同的时间点,用热板实验、斜坡实验来检测大鼠感觉、运动功能的恢复,通过胫骨前肌湿重比率、和坐骨神经指数(SFI)来检测大鼠神经肌肉功能,甲苯胺蓝染色定位,透射电镜观察髓鞘的恢复情况，使用大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒观察ANX代谢情况。

大鼠膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA试剂盒结果1.绘制细胞增殖生长曲线显示MenSCs在第3～5天时增长迅速,细胞活性较强;2.流式细胞仪鉴定MenSCs表达CD90和CD73,不表达CD34和HLA-DR;3.HE染色结果及ANX显示化学萃取法去除了ANX内的髓鞘及细胞结构,外膜结构完整;4.扫描电镜结果显示ANX组可见基膜结构,ANX和MenSCs共培养体系可见椭圆形的MenSCs在基膜间黏附生长;5.ANX内不表达NGF、NT3,ANX与MenSCs共培养体系内阳性表达NGF、NT3;6.移植术后4w实验结果显示,ANX+MenSCs组的患肢回缩时间优于单纯ANX组,且具有统计学意义(P<0.05),三组间的斜坡坡度无统计学意义(P>0.05),在数值上自体组优于其他两组,而ANX+MenSCs组又优于ANX组,自体移植组的SFI值和胫骨前肌湿重比率都优于ANX+MenSCs组和ANX组,且具有统计学意义(P<0.05),在数值上ANX+MenSCs组均优于ANX组。

参考文献

[1]Xenogeneic acellular nerve scaffolds supplemented with autologous bone marrow‐derived stem cells promote axonal outgrowth and remyelination but not nerve function[J].Bo Hou;;Meiqin Cai;;Chuan Chen;;Wanqing Ji;;Zhuopeng Ye;;Cong Ling;;Zhuopeng Chen;;Ying Guo.Journal of Biomedical Materials Research Part A,2018(12)

[2]A Comparison Between Two Collagen Nerve Conduits and Nerve Autograft:A Rat Model of Motor Nerve Regeneration[J].Eliana B.Saltzman;;Jordan C.Villa;;Stephen B.Doty;;Joseph H.Feinberg;;Steve K.Lee;;Scott W.Wolfe.Journal of Hand Surgery,2019

[3]Adipose‐derived stem cells and the stromal vascular fraction in polyglycolic acid‐collagen nerve conduits promote rat facial nerve regeneration[J].Mari Shimizu MD;;Hajime Matsumine MD,PhD;;Hironobu Osaki MD,PhD;;Yoshifumi Ueta PhD;;Satoshi Tsunoda PhD;;Wataru Kamei MD;;Kazuki Hashimoto MD;;Yosuke Niimi MD,PhD;;Yorikatsu Watanabe MD,PhD;;Mariko Miyata MD,PhD;;Hiroyuki Sakurai MD,PhD.Wound Repair and Regeneration,2018(6)

[4]Comparable functional motor outcomes after repair of peripheral nerve injury with an elastase‐processed allograft in a rat sciatic nerve model[J].Caroline A.Hundepool PhD MD;;Liselotte F.Bulstra MSc;;Dimitra Kotsougiani MD;;Patricia F.Friedrich AAS;;Steven E.R.Hovius PhD MD;;Allen T.Bishop MD;;Alexander Y.Shin MD.Microsurgery,2018(7)

[5]王贺颖.ANX联合经血源性间充质干细胞对大鼠坐骨神经缺损的影响[D].宁夏医科大学,2020.