脐动脉平滑肌细胞（人源）的培养

背景及概述^[1]

平滑肌细胞又叫平滑肌纤维，系构成平滑肌的纤维状长细胞。由于平滑肌所分布的部位不同，平滑肌细胞的长度很不一致，在小血管壁上的平滑肌细胞长度仅有20μm左右，妊娠期子宫壁平滑肌细胞可长达500μm，位于一般器官平滑肌细胞的长度约200μm左右，此细胞的宽度在7μm以内。血管平滑肌细胞是构成血管中层的主要细胞成份，其收缩、舒张、增殖、迁移和钙化等与心血管疾病的发生密切相关。因此，体外培养血管平滑肌细胞是研究CKD患者心血管疾病发病机制的重要手段。由于影响血管平滑肌细胞体外培养的因素很多，尤其是人血管平滑肌细胞的体外培养难度很大，因此国内外大多数实验室仍选用动物(牛、猪、大鼠等)的动脉作为血管平滑肌细胞体外培养的来源[3]。尽管动物的血管平滑肌细胞较容易培养，但其形态学及生物学特性与人血管平滑肌细胞存在一定的种间差异，由此得出的实验结果有可能不能准确反映人体的实际情况。

培养^[2]

1.脐动脉平滑肌细胞（人源）的体外培养

1）人脐动脉的分离：取产科自然分娩的健康胎儿脐带约20cm，置无菌的DMEM培养液中，于分娩后2h内送至细胞培养室。在超净工作台中，用无菌的PBS反复冲洗脐带，至脐带内、外血液冲洗干净为止，用眼科剪刀将脐带剪成3～4cm的小段，用眼科镊仔细剥离出脐动脉，置含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的无菌DMEM培养液中备用。

2）脐动脉平滑肌细胞（人源）原代培养：于超净工作台

内，用眼科镊尽量去除血管外膜的结缔组织，再纵向剪开血管，冲洗血管内壁数次，用湿棉签轻轻刮除血管内皮，将处理好的动脉中膜放入另一无菌小烧杯中，滴少许DMEM培养液，保持组织湿润。用眼科剪将血管中膜剪成约0.5～1mm3的小块，用弯头吸管将血管小块移入25cm2塑料培养瓶内，以5块/cm2密度均匀种植于培养瓶底部，翻转培养瓶，使贴有植块的瓶底朝上，在培养瓶内加含20%胎牛血清及100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的无菌DMEM培养液4mL，然后保持有植块的瓶底朝上，拧紧瓶盖，放入37℃、5%CO2培养箱内贴壁3h后，将培养瓶轻轻翻转，使植块刚好浸入培养液中。在37℃、5%CO2培养箱(湿度100%)内静置培养。3d后换新鲜培养液，以后每3d换液1次，每次只换2/3量，保留1/3的原液，直到植块周围细胞移出并融合成片时，即可传代。

3）脐动脉平滑肌细胞（人源）传代培养：将融合成片的原代培养的脐动脉平滑肌细胞（人源），在换液后的第2d，弃去原培养液，用无菌的PBS轻轻冲洗2遍，再用0.25%(W/V)胰蛋白酶溶液和0.02%(W/V)EDTA的1∶1混合消化液约2.5mL漂洗1遍，随即加入上述消化液2.5mL于室温(20°C～25℃)消化约2～3min，置镜下观察，见细胞收缩变圆且漂浮后，轻拍培养瓶，使细胞完全脱离瓶壁，随即加入新鲜含10%(V/V)小牛血清的DMEM培养液终止消化，用弯头吸管吸取培

养液，轻轻吹打细胞使分离均匀，镜下计数，调整密度为1.0×105/mL的细胞悬液，5mL/瓶传入新的培养瓶中，每3d换液1次，每次换2/3量，保留1/3原培养液，待细胞长至融合状态后，可再传代。

2.体外培养脐动脉平滑肌细胞（人源）的鉴定

1）细胞生长观察：生长在培养瓶内的活细胞，可直接在倒置显微镜下进行连续观察，并拍照记录。

2）细胞考马斯亮兰R250染色：将培养瓶中生长的血管平滑肌细胞传入放有无菌盖玻片的6孔板中传代培养，3d后取出长满细胞的盖玻片，用PBS轻轻轻冲洗1min；1%TritonX-1004℃处理30min，PBS轻轻冲洗3次，每次5min；4%多聚甲醛室温固定20min；0.2%考马斯亮兰R250染色30min，双蒸水漂洗3次，每次5min；自然凉干，二甲苯透明，加拿大树胶封片，显微镜下观察并摄像。

3）细胞α-SMA、Ⅷ因子免疫荧光染色：取出长满血管平滑肌细胞的盖玻片，用PBS轻轻冲洗2次，每次5min；95%乙醇固定15min，PBS轻轻冲洗3min；每个盖玻片上加一滴正常山羊血清IgG，室温下包被1h，PBS轻轻冲洗3次，每次5min；每个盖玻片上分别加一滴鼠抗人α-SMA、Ⅷ因子抗体(一抗，均按1∶100稀释)，阴性对照滴加PBS，37℃孵育1h，PBS轻轻冲洗3次，每次5min；每个盖玻片上滴加一滴被FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体(二抗，均按1∶200稀释)，37℃避光孵育1h，PBS充分轻轻漂洗后，直接置荧光显微镜下观察并摄像。

3.结果

1）脐动脉平滑肌细胞（人源）体外培养生长情况

原代培养细胞：血管植块贴壁培养约7d，少许平滑肌细胞开始从植块周边迁出(图1)；至14d左右，植块周围形成明显的平滑肌细胞生长晕，并围绕植块边缘呈束状向外放射延伸，细胞呈长梭形，胞质丰富，均质透明，可隐约看到细丝。细胞有较多的突起，核卵圆居中，可见1～2个核仁。经3～4周培养，植块的生长晕不断扩大，彼此融合，细胞密集呈束状放射状排列，形成典型的“峰-谷”样生长特征(图2)，可予以传代。传代后的血管平滑肌细胞于种植30min后开始贴壁，24h后完全贴壁，经过7～10d生长，细胞即可铺满瓶底，可予再次传代。

传代培养细胞　原代培养的脐动脉平滑肌细胞（人源）可以连续传代培养至第5代，每代细胞的对数生长期为第3～7d。5代以内细胞的生长特征没有明显变化，传代培养的血管平滑肌细胞仍可形成典型的“峰-谷”样生长特征。第5代后，尽管细胞仍可以传代，但细胞活力降低，增殖缓慢，难以融合。

2）脐动脉平滑肌细胞（人源）考马斯亮兰R250染色

人脐动脉VSMCs经考马斯亮兰R250染色后，光镜下血管平滑肌细胞呈长梭形、多角形，胞质内有与细胞纵轴平行排列的密集微丝，证实所培养的细胞为呈现典型收缩表型的平滑肌细胞，核呈椭圆形，有1～2个核仁(图3)。

3）脐动脉平滑肌细胞（人源）的α-SMA、Ⅷ因子免疫荧光染色　

人脐动脉VSMCs的α-SMA免疫荧光染色后，在荧光显微镜下见血管平滑肌细胞呈长梭形、多角形，细肌丝被染为绿色荧光，细肌丝沿细胞长轴密集分布，细胞核及肌丝间的胞浆不着色(图4)。Ⅷ因子免疫荧光染色阴性。证明培养的细胞为收缩表型的平滑肌细胞而非成纤维细胞及内皮细胞。

主要参考资料

[1]  新编实用医学词典

[2] 人脐动脉平滑肌细胞体外培养