大鼠脑微血管内皮细胞的相关研究

背景及概述^[1]

内皮细胞系指血管、淋巴管的内膜上皮将内腔面覆盖的细胞。多数是单层扁平上皮属中胎叶性的上皮。血液循环和组织中大单核的游走的吞噬细胞有人认为是来自增生的血管内皮。小鼠淋巴管内皮细胞分离自淋巴管组织；淋巴管由毛细淋巴管汇合而成。其形态结构与静脉相似，但管径较细，管壁较薄，瓣膜较多且发达，外形呈串珠状。脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障(BBB)的重要成分，与外周血管内皮细胞不同，它具有高跨内皮阻抗(TER)、细胞间紧密连接、极少的胞饮小泡、缺乏窗孔结构以及含有选择性双向跨细胞膜转运系统等独有的特征，从而使血脑屏障形成一个限制大多数极性分子和蛋白质运动的选择性低渗透性的屏障。由于体外培养的脑微血管内皮细胞保持了较多的其体内固有的特点，因此目前脑微血管内皮细胞体外培养模型己被广泛应用于血脑屏障的研究、脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究、新药筛选、脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究等领域。而大多数体内实验采用大鼠为动物模型，而且大鼠具有较多的细胞生物学研究所需的抗体可用，因此进行大鼠脑微血管内皮细胞的培养具有重要的意义。自从首次成功培养大鼠脑微血管内皮细胞以来，国内外有关大鼠脑微血管内皮细胞的分离和培养方法己有较多的报道，我们发现国内的方法多以组织匀浆、两次尼龙网过滤分离脑微血管段为主，也有采用酶消化、梯度离心及尼龙网过滤的[坷，但细胞得率均较低，而近些年来国外大多数方法采用以大脑皮质为材料、酶消化及梯度离心分离脑微血管段并进行原代培。由于原代培养中无法避免地混杂成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、星型胶质细胞等其他细胞的生长，而且工作量大、过程繁琐且费用高，进行较纯的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养一直是国内外的一个难点。

体外培养^[2]

1. 脑微血管段的分离与脑微血管内皮细胞原代培养

大鼠颈椎脱臼处死后浸泡于759毛乙醇中消毒3-5min百断头置于玻璃培养阻中，打开颅腔后取出全脑置盛有冷D-Hanks液的玻璃培养皿中解剖去除小脑、日]脑(包括海马)，随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后置于新的含冷D-Hanks液玻璃培养皿中，用细解剖摄去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质，用D-Hanks液漂洗次后，加入mlDMEM培养液，用虹膜剪将其剪碎成mm大小，加入0.1%II刑胶原酶(含30u/mlDNasel.1ml1大脑)混匀后37oC水浴消化1.5，离心(1000r/min，8min，主温)，去上请液，加入20%BSA悬浮混匀后离心(1000g，20min，4OC)或加入159毛葡聚85糖悬浮混匀后离心(4000r/min，20min，4OC)，去除中上层神经组织及大血管，保留底音沉淀，加ml0.1%胶原酶/分散酶(含20u/mlDNaseI)浮泪匀后37oC水浴消化，自心(1000r/min，8min，言温)，去上清液，加入mlDMEM培养液悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12ml50%Percoll(25000g，60min，4OC)，离心(1000g，10min，4OC)，靠近底部的红细胞层之仁的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM洗两次(离心1000r/min，5min，室温)，去上清液，加入DMEM完全培养液(含20%FBS100μglml肝素铀)悬浮后接种于涂布基质的35mm一次性塑料培养皿(1.5ml1培养皿，可接种个培养皿/大脑)，置于3TC5%C0培养箱内静置培养12-24后换液，并加入ng/mlbFGF，随后隔天换液。

2.结果

接种当时可见由圆形的内皮细胞构成的呈单枝状或分枝状的脑做血管段，并可见散在的单细胞及组织碎片(图1-1)；培养12-24后可见培养的细胞从贴壁的微血管段周围长出，细胞呈短梭形，区域性单层生长，经换液后微血管段的残余部分不断减少，成纤维细胞、周细胞等杂细胞含量较少：随着培养时间的延长，内皮细胞不断增殖，可见"旋涡状"分布，大约5-7天细胞达到融合，短梭形的内皮细胞占90%以上，但可见少量周细胞等杂细胞生长于内皮细胞单层表面或细胞克隆间隙(未示)。细胞生长过程见图1.细胞接种于纤连蛋白/N型胶原涂布的培养皿。

相关研究^[3]

有研究观察中药天麻素对培养的正常及缺血大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的影响，以探讨天麻素对BMEC的作用。方法：采用体外培养的BMEC，模拟脑缺血损伤，观察天麻素对其活性、生存率和一氧化氮(NO)的影响。结果：缺血损伤模型BMEC活性及生存率较正常对照组明显降低；不同剂量天麻素对正常对照组BMEC活性、生存率及NO含量有升高趋势；正常对照组不同剂量天麻素BMEC活性较缺血损伤模型组活性有明显升高(P0.05)；天麻素高剂量可明显提高缺血损伤BMECNO含量(P0.05)。结论：天麻素各实验剂量可增强缺血损伤BMEC活力，提高受损内皮细胞(EC)的生存率；促使ECNO分泌增加。

此外，有实验研究冰片对大鼠脑微血管内皮细胞ICAM-1表达量的影响。方法：采用自由落体撞击硬脑膜致伤方法制成大鼠脑挫裂伤模型，将大鼠伤侧脑皮质制成石蜡切片，运用免疫组化学染色技术观察空白对照组(C组：只灌服石蜡油)、冰片组(B组：灌服等量冰片石蜡油)、脑外伤组(M组：脑挫裂伤组)和脑外伤加冰片组(M+B组：脑挫裂伤大鼠灌服冰片石蜡油)大鼠脑皮质微血管内皮细胞(EC)膜表面细胞间粘附分子-1(ICAM-1)量的表达，并进行半定量分析。结果：C组EC无表达或有少量表达，服用冰片不能使ICAM-1表达增强，脑外伤后ICAM-1表达有明显增强(P0.001)，及脑外伤大鼠服用冰片可使ICAM-1表达明显减弱。结论：证明冰片促血脑屏障(BBB)开放与ICAM-1无关，冰片对脑外伤大鼠脑组织具有一定的保护作用.

主要参考资料

[1] 现代药学名词手册

[2] 大鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养

[3] 天麻素对体外模拟脑缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用

[4] 冰片对大鼠脑微血管内皮细胞ICAM-1表达量的影响