改良BIELSCHOWSKY神经染色液的应用

背景^[1-3]

改良BIELSCHOWSKY神经染色液是一种典型的镀银染色法，其基本原理为固定后的组织和切片浸染于银溶液中，再用还原剂处理，使银颗粒沉着在轴索的轴浆中，使之呈现深棕色或黑色。镀银后可在神经元胞浆内看到许多交错成网的细丝，并伸向树突及轴突中。这种染色法常用于诊断和鉴别某些神经系统肿瘤，如神经纤维瘤、节细胞性神经纤维瘤等呈现阳性反应，而神经鞘瘤等则为阴性。

改良Bielschowsky神经染色液由Bielschowsky硝酸银溶液、还原剂、Bielschowsky氨银溶液、氯化金溶液、海波溶液等组成。其特点包括渗透能力强、固定均匀、组织收缩小、染色效果好，且适用范围广，特别适合于富含结缔组织的标本和胚胎标本，能够软化皮肤角质，并可以用于植物组织的固定。此外，用该染色液固定的组织，细胞核及细胞浆染色十分清晰，特别是要显示免疫球蛋白、病毒包涵体（如Negri小体）、骨骼肌的横纹等组织时。

改良BIELSCHOWSKY神经染色液

改良BIELSCHOWSKY神经染色液通常包括以下改进：

缩短染色时间：通过优化染色液配方和染色条件，可以缩短染色时间，提高染色效率。

提高染色稳定性：改良BIELSCHOWSKY神经染色液通常采用更稳定的染料和缓冲液，以减少染色过程中的失真和褪色。

增强对比度：改良BIELSCHOWSKY神经染色液通常采用更高强度的染料或添加其他染料来增强对比度，使神经纤维更容易被观察和识别。

在使用改良Bielschowsky神经染色液时，一般需要进行以下步骤：首先，石蜡切片至8～15μm，脱蜡至水洗；然后，用蒸馏水洗1～2分钟；接着，将切片放入Bielschowsky硝酸银溶液中，并在37℃温箱内避光浸染25～35分钟；之后，再用蒸馏水洗2～3分钟；随后，用还原剂还原数秒，至切片呈现黄色为止；最后，用蒸馏水洗3～5分钟。

请注意，由于染色液中含有某些成分，可能会溶解火棉胶，因此如果用于火棉胶包埋的标本，需要进行洗脱处理。此外，标本尺寸不可太大，一般窄边不大于5mm。

应用^[4][5]

改良BIELSCHOWSKY神经染色液可以用于HMGB1对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞引导轴突生长的作用及其机制

SD大鼠脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后,抑制高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Box1,HMGB1)释放,观察脊髓损伤部位中星形胶质细胞(Astrocytes,Ast)极化相关蛋白的表达,轴突生长情况与运动功能的恢复情况。通过对体外培养的大鼠Ast进行划痕损伤,观察星形胶质细胞极化与HMGB1、Cdc42、α-Actinin4蛋白表达情况,探讨HMGB1对大鼠SCI后星形胶质细胞极化引导轴突生长与运动功能恢复的作用及其机制。

方法:观察大鼠脊髓1损伤后的星形胶质细胞极化情况以及轴突损伤情况。将SD大鼠分为6组:假手术组(sham组)、模型组SCI 12h、1d、3d、5d、7d组;使用改良Allen法建立SCI模型后,观察其星形胶质细胞极化情况与轴突损伤情况。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠SCI后外周血清中促炎因子HMGB1表达量;应用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测各组大鼠SCI后不同时间点脊髓中HMGB1、GFAP、Cdc42表达情况;同时应用HE染色和改良BIELSCHOWSKY神经染色液染色观察SCI后脊髓与轴突损伤情况。观察体外培养的星形胶质细胞划痕损伤后的形态变化情况。培养取自48h内新生的SD大鼠乳鼠的脊髓Ast,建立划痕损伤模型。实验共分为5组:正常组(Normal组,正常培养的大鼠脊髓Ast,不做任何处理)、划痕损伤6h(划痕损伤6小时的大鼠脊髓Ast)、划痕损伤12h(划痕损伤12小时的大鼠脊髓Ast)、划痕损伤24h(划痕损伤24小时的大鼠脊髓Ast)、划痕损伤48h(划痕损伤48小时的大鼠脊髓Ast)。通过光学显微镜观察各组星形胶质细胞的形态变化。此部分实验可以探究SCI后不同时间点中星形胶质细胞极化最明显的时间点,以支持后续实验。

探究抑制HMGB1后,大鼠脊髓Ast极化情况,轴突生长情况以及运动功能恢复情况。将SD大鼠分为4组:Sham组、SCI组、SCI+EP(HMGB1抑制剂丙酮酸乙酯)组、SCI+GL(HMGB1抑制剂甘草甜素)组,应用ELISA检测各组大鼠外周血清中促炎因子HMGB1的表达量;应用WB检测各组大鼠脊髓中HMGB1、GFAP、Cdc42、α-Actinin4的表达情况;同时应用改良BIELSCHOWSKY神经染色液染色观察SCI后脊髓轴突生长情况;通过观察与测试评价各组大鼠运动功能恢复情况。观察抑制HMGB1后,体外培养的大鼠脊髓Ast的极化情况。利用转染携带HMGB1沉默基因的慢病毒干扰细胞核部位蛋白的表达,并采用丙酮酸乙酯(EP)抑制HMGB1的表达。细胞分为6组:Normal组、Model组、外源性HMGB1组(Model+r HMGB1,细胞划痕后加入外源性HMGB1)、sh RNA转染组(Model+HMGB1sh RNA,正常星形胶质细胞与携带HMGB1沉默基因的慢病毒共同培养后进行细胞划痕)、阴性序列转染组(Model+non-targeting sh RNA,将正常星形胶质细胞与携带对HMGB1基因无影响的慢病毒共同培养后进行细胞划痕)以及Model+EP组(细胞划痕后加EP)。使用WB检测上述各组HMGB1、Cdc42、α-Actinin4表达情况,并通过光学显微镜观察各组星形胶质细胞的形态变化。

探讨大鼠SCI后抑制HMGB1对反应性星形胶质细胞引导轴突生长的可能机制。将大鼠分为6组:Sham组、SCI组、SCI+EP组、SCI+LPS(Toll样受体4激动剂脂多糖)组、SCI+LY(PI3K抑制剂LY294002)组、SCI+Casin(Cdc42抑制剂)组。WB检测各组大鼠脊髓组织中HMGB1、TLR4、PI3K以及Cdc42的表达量。应用改良BIELSCHOWSKY神经染色液染色观察SCI后各组脊髓轴突生长情况。研究HMGB1通过Toll样受体4(TLR4)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路对大鼠脊髓Ast损伤后极化的调节作用。

参考文献

[1]Bone mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles deliver microRNA-23b to alleviate spinal cord injury by targeting toll-like receptor TLR4 and inhibiting NF-κB pathway activation.[J].Nie Hongfei;Jiang Zhensong.Bioengineered,2021

[2]Genes and miRNAs as Hurdles and Promoters of Corticospinal Tract Regeneration in Spinal Cord Injury[J].Boido Marina;Vercelli Alessandro.Frontiers in Cell and Developmental Biology,2021

[3]Therapy of spinal cord injury by zinc modified gold nanoclusters via immune-suppressing strategies[J].Lin Sen;Li Dan;Zhou Zipeng;Xu Chang;Mei Xifan;Tian He.Journal of Nanobiotechnology,2021

[4]High mobility group box-1 serves a pathogenic role in spinal cord injury via the promotion of pro-inflammatory cytokines.[J].Chen KeBing;Chang MinMin;Wang ShengLi;Li YongXin;Wang YiXi;Xu ZhiGuang;Wang Hong;Zhao BingCheng;Ma WeiYing.Journal of leukocyte biology,2021

[5]王志强.HMGB1对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞引导轴突生长的作用及其机制[D].山西医科大学,2023.