一种过氧化氢酶及其应用

背景技术

过氧化氢酶（Hydrogen Peroxidase）又称触酶（Catalase，简称 CAT），是一类催化底物氧化还原反应的酶，其主要功能是催化过氧化氢分解成氧气和水。

过氧化氢酶的研究可追溯到19世纪初，迄今它已成为农业，以及与之相关的食品与乳制品业、纸浆和造纸业、以及农业环保产业中有应用价值的酶之一。过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用是催化过氧化氢分解为水和氧气，使得过氧化氢不至于与氧分子在铁螯合作用下反应生成非常厉害的-OH，过氧化氢酶的作用是使过氧化氢还原成水和氧分子。

过氧化氢酶可促进漂白的进行，可显著提高羊毛的白度和亲水性。这是由于过氧化氢酶促进羊毛纤维初始受到快速的浸蚀，致使羊毛漂白较易进行。因此，工业中可先利用过氧化氢酶对羊毛进行预处理，是纤维表面裸露，再进行漂白，效果会更好，且纤维损伤也易控制。

过氧化氢酶广泛分布于动物、植物组织中和绝大多数的好氧菌和少数的厌氧微生物中。动物肝脏、红细胞、植物叶绿体以及放线菌、细菌、真菌也含有过氧化氢酶，其中哺乳动物组织中 CAT 含量差异较大，肝脏和结缔组织含量分别为最高和最低，过氧化氢酶在上述细胞组织中主要是与细胞器如线粒体和过氧化物体结合的形式存在，红细胞中则以可溶的状态存在。不同来源的过氧化氢酶的性质差距较大，从动植物和人体内获得的过氧化氢酶的热稳定性较差；而微生物来源的过氧化氢酶的稳定性相对表现较好，此外，微生物还具有易培养、来源广、生产周期短且成本低等优点。因此，微生物过氧化氢酶必将成为过氧化氢酶工业化发展的重要方向，利用基因工程技术手段开发出新型活性高的过氧化氢酶菌株具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型过氧化氢酶及其应用。本发明通过构建含有过氧化氢酶基因的表达载体，并将其转化入黑曲霉（Aspergillus niger）中，构建得到黑曲霉工程菌株。该菌株能高效分泌表达过氧化氢酶，所产过氧化氢酶可广泛运用于食品、纺织、医药、造纸等领域中去除生产过程中的过氧化氢。

本发明一方面提供了一种过氧化氢酶，所述过氧化氢酶为：

（a）氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

（b）在（a）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有过氧化氢酶活性的酶。

本发明，另一方面提供了编码所述过氧化氢酶的基因，其一种编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

本发明还涉及一种表达载体，其携带有所述编码过氧化氢酶的基因。

本发明还涉及一种宿主细胞，其携带有所述表达载体。

本发明还涉及上述过氧化氢酶在降解过氧化氢中的应用。

有益效果:

本发明提供了一种新型过氧化氢酶，并构建了高效重组表达该酶的黑曲霉工程菌株，摇瓶发酵酶活高达3150U/mL。所述过氧化氢酶的最适作用pH值为8.5，最适作用温度为50℃，其在4-50℃水浴中静置1个小时，酶活比较稳定，几乎没有变化，在50-60℃水浴中静置1小时后仍能保留超过83%的酶活，70℃水浴中静置1小时后仍然能保留超过50%的活力，耐热效果显著。本发明提供的新型过氧化氢酶能有效催化过氧化氢分解生成水和氧气，10min时即将过氧化氢全部分解；而对照组所述市售过氧化氢酶，在20min时才将过氧化氢全部分解，取得了意料不到的技术效果，可广泛运用于食品、纺织、医药、造纸等领域中去除生产过程中的过氧化氢。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Haleet al., 2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

基因克隆：

申请人首先提取曲霉（Aspergillus sp.）WLP（该菌株由发明人王艺璇于2017年1月筛选自山东省青岛市崂山区林场的落叶表面）的基因组总DNA。然后以基因组总DNA为模板，利用上下游引物进行扩增。

PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃7min。

凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，送至北京华大基因研究中心进行测序分析。结果显示，扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。经NCBI Blast比对发现，该序列与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的过氧化氢酶序列的相似性仅为47%，为一新的等位基因。