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热敏型双链DNA特异性核酸酶注意事项

发布日期:2019/4/17 17:29:51

背景及概述[1]

核酸酶是一类催化核苷酸和核酸中的磷酸二酯键水解的酶,分内切核酸酶(endonucleases)和外切核酸酶(ex-onucleases),对紫外线引起的DNA大型光损伤和各种化学物与DNA形成的加合物的切除修复中起作用。在N-糖基化酶切除异常的碱基形成AP位点(见切除修复)后,如插入酶将正确的碱基插入AP位点仍不能达到完全修复时,即由AP内切核酸酶在AP位点或其旁边的5′端将DNA切开一个缺口,使一端成为5′-磷酸基,另一端成为3′-OH基。随之外切核酸酶再切除一些碱基。除AP内切核酸酶外,还有一些对某些DNA损伤有特异性的内切核酸酶。其中较特殊的是切除由紫外线产生的嘧啶二聚体的UV内切核酸酶。它有时还能作用于许多较大的螺旋扭曲变形损伤。由于UV内切核酸酶还具有外切作用,有时称之为“切除核酸酶”(ex-cinuclease)。参见切除修复、聚合和连接酶。

热敏型双链DNA特异性核酸酶是双链DNA特异性核酸酶。其特异性的识别降解双链DNA,对单链DNA或RNA几乎无活性,其降解dsDNA的能力比ssDNA高~5000倍。除此外,该双链DNA特异性核酸酶降解双链DNA的能力比bovineDNaseI高~30倍,因此特别适用于去除RNA样品中的基因组DNA污染。热敏型双链DNA特异性核酸酶可将DNA降解为2~8bp的产物,且55℃5分钟可使该酶不可逆失活,同时又能保持RNA和ssDNA的稳定性,因此产物无需再纯化,可直接用于后续反应。同时该酶与M-MLV和AMV的反应Buffer都是兼容的,可应用于反转录反应中去除样本中基因组DNA的污染,提高反转录效率。

使用注意事项[1]

1.1×dsDNaseBuffer:20mMTris-HClpH8,2mMMgCl2。该酶需要1~3mMMgCl2

2.该酶对DTT敏感,任何反应体系中不得包含DTT。

3.通常在RT反应中的用量为0.1~0.5U/20μl体系。

4.任何浓度的SDS、盐酸胍、β-mercaptoethanol或高盐离子(>300mM)均抑制该酶活性。

5.该酶的最佳反应温度为25~37℃,42℃30分钟后活性损失70%。

主要参考资料

[1] 卫生学大辞典