无绿藻通用PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

无绿藻通用PCR试剂盒是一种用于检测各种RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增的实验工具。该试剂盒采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。同时，在20uL反转录体系和50uL PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。该试剂盒中配制的酶均为进口的酶，保证了cDNA更长，基因的信息保留得更完整。此外，该试剂盒还采用了特异的RNase抑制剂，有效降低了由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。

无绿藻通用PCR试剂盒的包装规格通常为100uL的2×PCR MagicMix，以及100uL的源性成分PCR引物混合液。使用该试剂盒进行PCR反应时，需要在0.5mg引物中加入总RNA样品，总体积不大于15uL。然后在70℃下打开模板链形成的二级结构，接着加入其他成分进行延伸温度在37~42℃之间的PCR扩增。

无绿藻通用PCR试剂盒

无绿藻通用PCR试剂盒的操作步骤如下：

1.样本采集：从患者体内采集血液、粪便、组织等样本，并将其保存在无菌容器中。

2.DNA提取：将采集到的样本进行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取试剂盒。提取后的DNA应保存在-20°C或更低的温度下。

3.PCR反应体系准备：根据无绿藻通用PCR试剂盒的要求，配制PCR反应体系，包括引物、荧光探针、dNTPs、DNA聚合酶等。

4.PCR反应：将提取的DNA加入到PCR反应体系中，进行PCR反应。反应条件和时间根据试剂盒说明书的要求进行设置。

5.结果分析：将PCR反应后的产物进行荧光信号检测，根据荧光信号的出现情况判断是否存在无绿藻的含量。

应用^[4-5]

无绿藻通用PCR试剂盒可以用于小鼠皮肤无绿藻感染差异表达基因的筛选

小鼠皮肤无绿藻感染动物模型的构建目的：构建小鼠皮肤无绿藻感染模型。

方法：BALB/C小鼠分为4组,A组为免疫抑制小鼠,腹部皮下接种1x109孢子数/ml中型无绿藻波多黎各变种悬液组；B组为免疫抑制小鼠,腹部皮下接种1x106孢子数/ml悬液组：C组为健康小鼠,腹部皮下接种1x109孢子数/ml悬液组；D组为对照组,健康小鼠腹部皮下接种生理盐水溶液,每个部位接种量均为200μl。接种后第7、14、28天时观察各组小鼠腹部皮损变化,并进行腹部皮肤病理及无绿藻通用PCR试剂盒真菌检查。

结果：A、B、C组小鼠接种处均出现丘疹、脓肿,部分出现溃疡、结痂,感染率均为100%。A、B、C三组小鼠的腹部皮损直径,组内相比,均在第7天时最大(P<0.05),分别为(6.75±1.09)mm、(5.88±1.17)mm和(5.96+0.99)mm;组间相比,在接种后第7、14天时,差异无统计学意义(P>0.05),在第28天时,A组最大(P<0.05)为(4.38±0.86)mm。实验组基本病理改变为坏死、脓肿、肉芽肿形成,HE染色和PAS染色均可见孢子,皮损直接镜检可见孢子,无绿藻通用PCR试剂盒检测存在感染，培养为无绿藻生长。对照组未感染无绿藻。

小鼠皮肤无绿藻感染差异表达基因的筛选目的：利用基因表达谱芯片筛选小鼠感染无绿藻皮肤组织的差异表达基因,探讨这些基因在皮肤无绿藻病中的作用,从而对皮肤无绿藻病有更新的认识

方法：分别提取免疫抑制小鼠感染无绿藻的皮肤组织和对照组皮肤组织,抽提总RNA,反转录成cDNA同时进行单色标记,和小鼠全基因组表达谱芯片杂交,经过芯片扫描和数据处理,分析出差异表达的基因,并对部分差异基因采用无绿藻通用PCR试剂盒实时荧光定量PCR的方法进行验证。结果：感染无绿藻的小鼠皮肤组织中表达差异>2倍的基因共有9902个,其中表达上调的基因4974个,表达下调的基因4928个。生物信息学分析发现,差异基因功能主要涉及炎症反应、免疫应答、信号转导、细胞粘附等多个生物学过程。另外还发现了一些有意义的信号通路如趋化因子信号通路、Jak-STAT信号传导途径、Toll样受体信号传导途径等。差异基因的实时荧光定量PCR结果与基因芯片的结果趋势一致。

参考文献

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