吴茱萸碱的药理作用及应用

背景及概述^[1]

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth，石虎Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.Var.ibodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实，始载于《神农本草经》，距今已有上百年历史，是一种传统中药。具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效，常用于厥阳头痛、寒病腹痛、呕吐吞酸、五更泄泻、高血压等症。吴茱萸碱是其主要生物碱成分，是色胺吲哚类生物碱，其分子式为C19H17N3O，分子量为303.36。黄色片状晶体或结晶性粉末。熔点278℃，比旋光度[α]_D²⁰+352°(丙酮)。溶于丙酮，微溶于氯仿，不溶于水、苯及石油醚。遇浓硫酸或浓盐酸显橙红色，放置转为红棕色，加水稀释转为蓝色，碱化后产生污色沉淀。从吴茱萸果实中提取分离而得。有升高血压作用。。

药理作用及应用^[2]

1. 抗肿瘤作用

1）抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡坏死吴茱萸碱能诱导人肝癌HepG2、黑色素瘤A375-S2、宫颈癌HeLa等多种肿瘤细胞凋亡。用64、16、4、1、0.25μmol·L-1浓度的吴茱萸碱处理HepG2细胞72h的抑制率分别为74.0%、69.0%、60.5%、44.0%、16.4%。DAPI染色后吴茱萸碱组癌细胞均表现出较为典型的细胞凋亡特征。流式细胞仪检测1μmol·L-1吴茱萸碱作用24h和36h出现亚二倍体凋亡峰，细胞周期阻滞于G2/M期。吴茱萸碱能引起A375-S2细胞核转录因子NF-κB易位，用泛素-蛋白酶体抑制剂MG132预处理后，吴茱萸碱在24h引起更多的A375-S2细胞死亡。MG132能减少胞外调节蛋白激酶（ERK）磷酸化，激活caspase-3，增加Fas-L表达，下调Bcl-2的表达，提示吴茱萸碱对A375-S2细胞诱导凋亡的作于与caspase有关，并能通过泛素-蛋白酶体途径增强。吴茱萸碱能剂量依赖性降低未分化甲

状腺癌（ARO）细胞增值率，将癌细胞阻滞在G2/M期伴随cdc25c、cyclinB1、cdc2-p161蛋白表达增加，在48h至72h能观察到细胞凋亡，caspase-8、caspase-9和caspase-3被激活，提示吴茱萸碱抑制ARO细胞增殖和caspase通路有关。研究发现吴茱萸碱能够抑制体外结肠癌lovo细胞的增殖，60mmol·L-1时能阻滞细胞停留在S期并引起细胞凋亡，caspase-8、caspase-9和caspase-3被激活，进一步在结肠癌移植瘤模型中发现吴茱萸碱增加Tunel阳性细胞数，这些结果表明吴茱萸碱通过caspase凋亡通路和阻滞癌细胞停留在S期在离体和在体两方面抑制人结肠癌细胞增殖。

2）抑制肿瘤细胞侵袭和转移

研究中发现当肿瘤细胞在含有吴茱萸碱的纤维素结合板上培养时，其扩散受到明显抑制。用10mg/ml处理的小鼠结肠癌细胞26-L5移植到小鼠体内后，肺转移抑制率达到70%。而在26-L5细胞荷瘤鼠接种后第六天给予10mg/kg吴茱萸碱，肺转移抑制率达48%，与顺铂产生的抑制作用相当。相对于顺铂会严重减少小鼠体重，吴茱萸碱并不对实验期间小鼠体重产生影响。因此，吴茱萸碱有望作为一种有效化合物用于治疗肿瘤转移。

2. 对心血管系统作用

吴茱萸碱（0.03μmol·L-1～1μmol·L-1）剂量依赖性增强豚鼠离体心房收缩力，加快收缩频率，达到1μmol·L-1时能引起收缩。竞争性辣椒素受体（VR1）拮抗剂Capsazepine(10μmol·L-1)、非竞争性VR1拮抗剂钌红（10μmol·L-1）和选择性降钙素基因相关肽（CGRP）受体拮抗剂CGRP8-37（10μmol·L-1）能取消这种作用，提示吴茱萸碱对豚鼠离体心房的兴奋作用与激活VR1促进CGRP释放有关。吴茱萸碱能防止心脏过敏性损伤。用特异性抗原牛血清白蛋白预先致敏的豚鼠心脏冠脉流量减少，左心室压明显降低，心率加快，P-R期延长。使用吴茱萸碱（0.3μmol·L-1或1μmol·L-1）能够显著增加冠脉流出液中CGRP的含量，改善心脏功能，缩短P-R期。1μmol·L-1吴茱萸碱还能抑制窦性心动过速。吴茱萸碱对心脏过敏反应的保护作用可被CGRP8-37取消，提示吴茱萸碱对心脏过敏损伤的保护作用与CGRP的释放有关。

3. 减肥、降血糖作用

吴茱萸碱干预大鼠13周后，降低肥胖大鼠体重和Lee's指数，降低肥胖大鼠内脏脂肪重量和内脏脂肪重量指数，并降低肥胖大鼠血清总胆固醇和甘油三酯含量。吴茱萸碱能逆转肥胖并发的血管肥厚；与正常大鼠相比，肥胖大鼠胸主动脉组织和DRG中瞬态电压感受器阳离子通道（TRPV1）表达降低，血清和腹主动脉CGRP增加。吴茱萸碱和辣椒素能增加胸主动脉组织和DRG中TRPV1的表达；吴茱萸碱能降低血清和腹主动脉中CGRP含量，其作用机制可能与调节血清、血管组织和DRG中CGRP和TRPV1的表达有关。4mmol·L-1的吴茱萸碱能抑制人类白前脂肪细胞（HWP）的分化，并下调基因启动子保守序列（GATA）结合蛋白2和3（GATA2，GATA3）mRNA和蛋白的表达，提示吴茱萸碱可能具有较好预防肥胖的作用。体外实验中，吴茱萸碱能抑制3T3-L1和C3H10T1/2等脂肪细胞的分化，尤其是在早期诱导阶段。给db/db小鼠连续14天腹腔注射吴茱萸碱，小鼠体重明显减少，附睾白色脂肪组织与体重比值显著降低。血糖水平降低程度与罗格列酮相当，血浆胰岛素降低水平比罗格列酮更显著，吴茱萸碱还能改善脂肪和糖原沉积引起的肝损害。

4. 抗炎镇痛作用

研究吴茱萸碱是否能抑制低氧诱导的炎症反应，结果发现吴茱萸碱能够剂量依赖性的抑制环氧化物酶（COX-2）和一氧化氮合酶（iNOS）表达，减少前列腺素（E2）释放。阻断低氧诱发的AKt、70kDa核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）和4E结合蛋白（4E-BP）磷酸化，调节低氧诱导性因子（HIF-1alpha）翻译过程，对mRNA水平和蛋白降解率没有影响。提示吴茱萸碱主要通过介导Akt和p70S6K的去磷酸化而抑制低氧诱导的COX-2表达。吴茱萸碱显著抑制醋酸引起的扭体次数，给予吴茱萸碱的小鼠离体回肠丧失了对感觉神经刺激的反应，保留了对迷走神经刺激的反应，吴茱萸碱通过感觉神经脱敏而发挥镇痛作用。

5. 内分泌系统

吴茱萸碱可以通过降低细胞内环磷酸腺苷（cAMP）相关途径的活性，抑制3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）等类固醇激素生成相关酵素的活性，降低并影响信号转导与RNA活化蛋白（StAR）表达，直接作用于大鼠肾上腺皮质束网带细胞抑制皮质酮分泌。10-4mol·L-1吴茱萸碱孵育大鼠睾丸间质细胞（TICs）1、2、4h有效降低睾酮的基本水平以及人体绒毛膜促性腺激素刺激的睾酮分泌，抑制弗司扣林引起的睾酮释放。吴茱萸碱还可抑制8-Br-cAMP和雄甾烯二酮引起的睾酮释放。

6. 对阿尔茨海默症作用

利用Morris水迷宫实验检测吴茱萸碱对阿尔茨海默症小鼠学习和记忆能力的影响，正电子发射断层成像术/计算机断层成像术（PET/CT）检测脑组织糖摄取，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平，蛋白质印迹法（Westernblot）测定COX-2蛋白表达水平，结果在SAMP8和APP(swe)/PS1 (ΔE9)转基因小鼠模型中发现100mg·kg-1·d-1吴茱萸碱显著改善小鼠学习和记忆能力，逆转阿尔茨海默症引起的糖摄取抑制，降低IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF-α）、COX-2等与阿尔茨海默症引起的炎症相关的因子。提示吴茱萸碱能改善阿尔茨海默病转基因模型小鼠的认知能力。

7. 免疫抑制

吴茱萸碱通过Bcl-2、CDK2上调，抑制8周龄雄性C57BL/6小鼠体外培养的脾和胸腺淋巴细胞增殖诱导其凋亡，细胞分泌L-2和L-12的生物活性也明显下降，细胞内ROS水平增高，但随着药物处理时间的延长，细胞死亡率升高，死亡细胞内ROS水平明显降低。分离BALB/c小鼠骨髓细胞，经GM-CSF体外诱导培养10天的未成熟DC细胞（iDC），利用SuperArray公司小鼠DC与抗原提呈细胞基因芯片MM-604对细胞功能相关基因进行检测，结果表明吴茱萸碱对DC作用涉及多个基因的表达调控，这些基因调控并影响着DC功能、分化和成熟。进一步利用抗体芯片技术和ELISA检测吴茱萸碱对DC分泌相关细胞因子的影响，结果显示吴茱萸碱促进了iDC和成熟DC（mDC）抗原提呈功能，对iDC、mDC的细胞因子IL-10、IL-12分泌功能无影响，吴茱萸碱处理iDC后上调大于2倍的细胞因子有7个，处理mDC后上调大于2倍的细胞因子有2个，这些细胞因子影响着DC的抗原摄取、迁移、抗原提呈，为进一步寻找药物靶点提供了线索。

制备^[3]

吴茱萸中分离吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，具体制备方法包括以下步骤：

(1)取原料适量，加入1-50倍量的溶剂，所述溶剂为：甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯，或其混合溶剂，混合溶剂体积比控制为1：9～9：1，或甲醇、乙醇、丙酮水溶液，控制体积比为50％～95％，提取1-5次，每次1-4h，合并提取液回收溶剂得到浸膏；

(2)将步骤(1)中得到的浸膏用1-100倍量的低极性溶剂脱脂1-5次，然后再用1-100倍浸膏量的1-10％的盐酸、硫酸、硝酸或磷酸水溶液浸泡洗涤1-48h，如此操作反复进行1-6次；

(3)将步骤(2)中得到的洗涤后的固体加入到1-100倍量的1-20％的氨水、氢氧化钙、氢氧化钠或氢氧化钾水溶液中，充分溶解1-48h，过滤，取出残余固体，再加盐酸、硫酸、硝酸或磷酸水溶液反应1-48h，过滤或离心，得到固体；

(4)将步骤(3)中得到的固体用1-200倍量二氯甲烷、氯仿、丙酮或乙酸乙酯溶解，再过滤或离心，得到固液两相，取出固液相分别用1-100倍量1-30％的氨水、氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、磷酸一氢钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的水溶液调节反应1-48h，液相部分经反应后，析出固体，过滤或离心，洗涤，干燥，得到吴茱萸碱粗品，固相部分经反应后，过滤或离心，洗涤，干燥，得到吴茱萸次碱粗品；

(5)将上述吴茱萸碱粗品和吴茱萸次碱粗品，用二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、异丙醇或它们的混合溶剂进行结晶和重结晶，最终得到高纯度的吴茱萸碱和吴茱萸次碱晶体。

主要参考资料

[1] 化学物质辞典

[2] 吴茱萸碱的药理学研究进展

[3] CN201810317452.0从吴茱萸中分离吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法