OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞的应用

背景^[1-3]

OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞是一种来源于人弥漫大B淋巴瘤细胞的细胞系。这些细胞通常在实验室中被用于研究淋巴瘤的发生和发展，以及测试新的治疗策略。

OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞具有一些特殊的生物学特性，例如表达CD19、CD20、CD22等表面标记，以及在适当的刺激下可以产生抗体。这些特性使得OCI-LY8细胞系成为研究人淋巴瘤的重要工具。

OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞

OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞培养操作

1)复苏OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞可以用于生物钟基因Per2、Bmal1在肿瘤细胞系Raji、Hut、OCI-LY8及HL-60中的昼夜表达规律

探索血液系统肿瘤细胞系中生物钟基因Bmal1及Per2在转录水平上的表达情况，明确体外培养条件下的血液系统肿瘤细胞系中是否存在生物钟基因转录水平上的昼夜波动，并对其转录水平变化进行以时间为变量的余弦函数拟合，以预测体外培养条件下生物钟基因转录的高峰和低谷时段，为进一步研究血液系统肿瘤发生、发展与钟基因的关系提供理论基础。

研究对象和方法

1研究对象1）人伯基特淋巴瘤Raji细胞系；2）人皮肤T细胞淋巴瘤Hut-78细胞系；3）OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞；4）髓系白血病HL-60细胞系。

2方法2.1细胞培养四种细胞系分别接种于含10%胎牛血清的RIPA1640培养基，并在C02、37℃培养箱中常规培养，间隔2-3天换液。2.2生物钟基因节律表达的同步诱导细胞生长稳定时(对数期内)更换含0.5%胎牛血清的RIPA1640培养基进行饥饿培养2天，饥饿培养后更换培养基为50%胎牛血清的PIRA1640培养基培养进行血清休克诱导同步节律的产生，并将此时刻时间记为ZT0，2小时后更换无血清培养基。按照时间顺序，将ZT0时刻后4小时计为ZT4，8小时后计为ZT8，以此类推。2.3测定mRNA含量在ZT（0、4、8、12、16、20、24）时刻分别使用Trizol提取不同细胞系的总RNA，检测RNA纯度和完整性；使用逆转录试剂盒合成cDNA；应用Real-timePCR定量测定Per2、Bmal1mRNA的表达。2.4统计学分析将目的基因的Ct值与内参基因Ct值的差值△Ct作为基因的相对表达水平。对同种细胞同种基因在不同时间点的△Ct值进行正态性及方差齐性检验，对符合条件的数据进行单因素方差分析，数据采用Mean±SD表示，P<0.05为差异具有显著性。通过方差分析判定差异有显著性的基因则进行余弦节律拟合。应用余弦分析软件和CronoLab软件获取节律性参数，用于拟合的余弦函数方程为F（t）=M+Acos(ωt+φ)其中M为中值；A为节律震荡的振幅；φ为峰值相位，是震荡达到峰值的时刻所换算出的角度，根据ω角度（360°/24h）可将其换算成ZT时点。

结果1.血清休克法节律诱导的Raji细胞中生物钟基因Bmal1在一天内不同时间点的表达差异无统计学意义（P>0.05），认为无法通过血清休克法诱导Raji细胞内Bmal1基因的节律性表达；血清休克法可诱导的OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞、Hut-78、HL-60细胞中生物钟基因Bmal1与Per2及Raji细胞中生物钟基因Per2在一天内不同时间点mRNA转录水平存在昼夜节律性，且这种细胞内生物钟基因表达的节律性可用余弦函数来进行的大致描述；

2. 应用余弦分析软件及CronoLab软件进行余弦方程拟合，将同种细胞同种基因转录mRNA的量在一天内的相对变化情况拟合为以时间t（小时）为变量的余弦函数，可得余弦方程为：OCI-LY8细胞转录Bmal1可拟合为F（t）=13.9+5.4cos（15t），转录Per2可拟合为F（t）=9.6+4.1cos（22.5t+90）；Hut-78细胞转录Bmal1可拟合为F（t）=10.6+6.0cos（45t+180），转录Per2可拟合为F（t）=7.5+5.0cos（15t+180）；HL-60细胞转录Bmal1可拟合为F（t）=18.9+3.5cos（22.5t+180），转录Per2可拟合为F（t）=7.0+3.6cos（15t+240）；Raji细胞转录Per2可拟合为F（t）=9.6+3.6cos（15t+180）；

3. 通过余弦函数可知OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞的Bmal1基因转录水平大致以24小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT0和ZT12，Per2基因的转录水平大致以16小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT12和ZT4；Hut-78细胞的Bmal1基因转录水平大致以8小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT4和ZT8，Per2基因的转录水平大致以24小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT12和ZT0；HL-60细胞Bmal1基因的转录水平大致以16小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT0和ZT8，Per2基因的转录水平大致以24小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT8和ZT20；Raji细胞Per2基因的转录水平大致以24小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT12和ZT0；

结论1.体外培养条件下可通过血清休克法诱导生物钟基因Bmal1和Per2在OCI-LY8细胞系|人弥漫大B淋巴瘤细胞、人皮肤T淋巴瘤Hut-78细胞系、髓系白血病HL-60细胞系中转录水平上的节律性表达及Per2在人伯基特淋巴瘤Raji细胞系中转录水平的节律性表达,而不能诱导Bmal1在人伯基特淋巴瘤Raji细胞系中转录水平的节律性表达。

参考文献

[1]Circadian expression of clock genes in mouse macrophages,dendritic cells,and B cells.Adam C.Silver;;Alvaro Arjona;;Michael E.Hughes;;Michael N.Nitabach;;Erol Fikrig.Brain Behavior and Immunity,2011

[2]Genetics of Circadian Rhythms in Mammalian Model Organisms.Phillip L.Lowrey;;Joseph S.Takahashi.Advances in Genetics,2011

[3]Clock Gene Expression Levels and Relationship With Clinical and Pathological Features in Colorectal Cancer Patients.G.Mazzoccoli;;A.Panza;;M.R.Valvano;;O.Palumbo;;M.Carella;;V.Pazienza;;G.Biscaglia;;F.Tavano;;P.Di Sebastiano;;A.Andriulli;;A.Piepoli.Chronobiology International,2011

[4]Expression of circadian genes correlates with liver metastasis and outcomesin colorectal cancer.Takashi Oshima;;Seiich Takenoshita;;Makoto Akaike;;Chikara Kunisaki;;Shoich Fujii;;Akito Nozaki;;Kazushi Numata;;Manabu Shiozawa;;Yasushi Rino;;Katsuaki Tanaka;;Munetaka Masuda;;Toshio Imada.Oncology Reports,2011

[5]刘炜青.生物钟基因Per2、Bmal1在肿瘤细胞系Raji、Hut、OCI-LY8及HL-60中的昼夜表达规律[D].郑州大学,2015.