HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系是一种来源于人直肠腺癌的细胞系，通常用于研究肿瘤细胞生物学、药物筛选和抗肿瘤药物开发等。这种细胞系具有一些特殊的生物学特性，如高度侵袭性、易转移等，为直肠癌的研究提供了重要的实验模型。

HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系的保存和运输需遵循一定的低温避光条件，以保证细胞的活性和稳定性。同时，使用这种细胞系进行实验时，需注意以下几点：

HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系培养条件：该细胞系需要在含有一定浓度的血清、抗生素和生长因子的培养基中生长，同时需控制温度、湿度和二氧化碳浓度等条件。

HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系传代方法：HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系的传代方法通常采用胰酶消化法或胶原酶消化法，传代比例根据实验需求进行适当调整。

HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系细胞形态：HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系的形态通常为贴壁生长，呈现圆形或卵圆形，有时可见细胞之间形成突起或形成细胞团。

HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系

HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系培养步骤：

1）复苏HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

应用^[4-5]

HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系可以用于结直肠癌侵袭转移过程中缺氧诱导因子1-α与FasL的表达及意义

对结直肠癌侵袭转移研究的基础上,探讨肿瘤发生发展过程中HIF-1α与FasL的表达,以期进一步了解结直肠癌的侵袭转移机制,为临床防治提供新的靶点与理论依据。

方法:1.采用分子克隆方法,将我室已构建的FasL-pcDNA3.1(+)质粒与pcDNA3.1(-)质粒进行重组,得到新的FasL-pcDNA3.1(-)质粒并进行鉴定。通过脂质体转染法将空质粒、FasL-pcDNA3.1(+)与FasL-pcDNA3.1(-)质粒分别转染人HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系,构建侵袭力不同的结直肠癌细胞HR-8348L、HR-8348F和HR-8348As并加以鉴定;以未转染细胞HR-8348B为空白对照,观察细胞形态,检测各组细胞的侵袭能力与增殖速度。

2. 采用化学缺氧法构建四组HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系缺氧模型,免疫细胞化学方法检测各组细胞缺氧12h后HIF-1α表达水平,计算阳性表达百分率;Western blot方法定量检测缺氧0h、6h、12h及24h各组细胞内HIF-1α的表达;并在缺氧12h时相下,应用流式细胞仪测定各组细胞周期的分布,MTT法测定各组细胞增殖能力的改变,TUNEL法测定各组细胞凋亡状况。

3. 采用免疫组织化学方法,对120例结直肠癌组织及癌旁组织、30例结肠腺瘤组织及28例结直肠癌肝转移组织中HIF-1α与FasL的表达情况进行检测,并分析HIF-1α表达与结肠癌临床病理特征和FasL水平之间的关系。

结果1.新构建质粒FasL-pcDNA3.1(-)符合要求,FasL酶切片断及PCR片断大小正确,测序正确率为99.2%;各质粒转染成功,RT-PCR方法可分别自HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系和HR-8348As细胞中得到FasL和As-FasL片断;倒置显微镜下观察各组细胞,见HR-8348F细胞异型性更明显;单层细胞体外侵袭实验见HR-8348F细胞穿透Transwell滤膜的细胞数目为12.930±2.434,显著多于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As细胞(分别为8.133±1.959,7.670±2.093和7.870±1.685)(P＜0.05);HR-8348B、HR-8348L、HR-8348F和HR-8348As细胞的群体倍增时间分别为28.3h、41.0h、24h和35.4h。

2. 缺氧12h后,HR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系HIF-1α蛋白阳性率为76.0%,显著高于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As细胞(分别为48.5%,43.0%和39.5%)(P＜0.05),而后三组细胞间无显著性差异(P＞0.05)。Western blot检测示HIF-1α蛋白于120kD处显色;比较不同缺氧时相各组细胞内HIF-1α的表达水平,缺氧0h与6h,各组样品中HIF-1α表达微量;缺氧12h,HR-8348F细胞内HIF-1α水平较0h和6h时明显增高(P＜0.05),而HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As细胞内HIF-1α表达与6h时无明显变化(P＞0.05);缺氧24h,HR-8348F细胞内HIF-1α表达仍处于较高水平,但与缺氧12h表达量比较差别不显著(P＞0.05),HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As细胞内HIF-1α表达水平则较缺氧12h略有下降,但不具备统计学意义(P＞0.05);组间比较,缺氧0h、6h时各组细胞HIF-1α蛋白水平无显著性差异(P＞0.05),缺氧12h、24hHR-8348人直肠腺癌贴壁细胞系HIF-1α水平显著高于HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As细胞(P＜0.01)。测定缺氧状态下的细胞生物学特性,见HR-8348F细胞的增殖指数(60.43±3.61)显著高于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As细胞(40.01±3.22,41.30±3.96和35.87±4.28)(P＜0.05),增殖抑制率和凋亡指数(17.30±2.08和13.10±1.06)显著低于HR-8348B、HR-8348L、HR-8348As细胞(33.70±4.56和21.60±1.33,34.20±4.12和20.10±1.17,38.00±4.79和23.90±1.25)(P＜0.05)。

参考文献

[1]Regulation of physiological responses to continuous and intermittent hypoxia by hypoxia‐inducible factor 1.Gregg L.Semenza.Experimental Physiology,2006

[2]Reconstitution of human hypoxia inducible factor HIF-1 in yeast:A simple in vivo system to identify and characterize HIF-1αeffectors.Georgia G.Braliou;;Emmanouil Venieris;;Alkmini Kalousi;;George Simos.Biochemical and Biophysical Research Communications,2006

[3]Oncological implications of hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)expression.Jill L.O’Donnell;;Myles R.Joyce;;Aoife M.Shannon;;Judith Harmey;;James Geraghty;;David Bouchier-Hayes.Cancer Treatment Reviews,2006

[4]Targeting the Fas/Fas ligand pathway in cancer.O’Brien;;Nally;;Kelly;;O’Connor;;Shanahan;;O’Connell.Expert Opinion on Therapeutic Targets,2005

[5]赵菲.结直肠癌侵袭转移过程中缺氧诱导因子1-α与FasL的表达及意义[D].第三军医大学,2009.