大鼠乳腺成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠乳腺成纤维细胞分离自乳腺组织；乳腺位于皮下浅筋膜的浅层与深层之间，浅筋膜伸向乳腺组织内形成条索状的小叶间隔，一端连于胸肌筋膜，另一端连于皮肤，将乳腺腺体固定在胸部的皮下组织之中。

乳腺是哺乳动物少数可以重复经历生长、功能分化和退化过程的器官之一。纤维结缔组织伸入乳腺组织之间，形成许多间隔，这些纤维结缔组织对乳房起固定作用，而纤维结缔组织是由成纤维细胞构成的。

大鼠乳腺成纤维细胞

成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。

成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。刚分离的乳腺成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。

30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。

大鼠乳腺成纤维细胞培养操作

1）复苏大鼠乳腺成纤维细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）大鼠乳腺成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）大鼠乳腺成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

大鼠乳腺成纤维细胞可以用于丹栀逍遥散调控肿瘤相关成纤维细胞抑制乳腺癌生长、转移及分子机制

利用Transwell体系建立肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibro blast,CAF)与MDA-MB-231细胞共培养模型,探讨丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞生长、转移及其分子机制,揭示丹栀逍遥散可能通过调控CAF途径抑制乳腺癌。

材料与方法:45只SPF级SD雄性大鼠(250±10)g,适应性饲养7d后,按随机数字表法将大鼠随机分3组,即空白组、丹栀逍遥散组、西黄丸组,每组15只。按照人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠丹栀逍遥散等效剂量为8.99g·kg-1,大鼠西黄丸等效剂量为0.55g·kg-1,空白组给予生理盐水灌胃,每组连续给药7d,每日1次。在末次给药1h后,麻醉,腹主动脉取血。室

温条件下放置2h,使用低温离心机分离血清,在4℃、1500rpm·min-1条件下,将血液离心10min。收集同组血清并56℃灭活30min。将灭活的血清分装在1.5m L的EP管中,放置于-80℃条件下保存。运用条件培养基诱导HMF细胞转化为CAF,免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达,鉴定模型。

运用CCK-8法检测15%丹栀逍遥散含药血清在作用12h、24h、48h、72h时,通过调控CAF分别对MDA-MB-231细胞增殖的影响;细胞侵袭实验检测丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响;细胞黏附实验检测丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对MDA-MB-231细胞黏附能力的影响;

流式细胞术分析丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对MDA-MB-231细胞凋亡与细胞周期的影响;免疫印迹法(Western blot)检测丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对MDA-MB-231细胞低氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、单羧酸转运蛋白1(Monocarboxylate transporter 1,MCT1)、单羧酸转运蛋白4(Monocarboxylate transporter 4,MCT4)、小窝蛋白-1(Caveolin-1)、CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)、CD47、巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory,MIF)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)蛋白表达的影响。

结果:CAF的鉴定免疫荧光结果显示,α-SMA在HMF细胞中表达很低,而在CAF中表达明显增高(P<0.01)。

参考文献

[1]Cancer-associated fibroblast(CAF)-derived IL32 promotes breast cancer cell invasion and metastasis via integrinβ3–p38 MAPK signalling.Siyang Wen;;Yixuan Hou;;Lixin Fu;;Lei Xi;;Dan Yang;;Maojia Zhao;;Yilu Qin;;Kexin Sun;;Yong Teng;;Manran Liu.Cancer Letters,2019

[2]The Antitumor and Immunomodulatory Effect of Yanghe Decoction in Breast Cancer Is Related to the Modulation of the JAK/STAT Signaling Pathway.Dan Mao;;Lei Feng;;Hui Gong;;Hwan-suck Chung.Evidence-Based Complementary and Alternative Medi,2018

[3]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.Freddie Bray BSc,MSc,PhD;;Jacques Ferlay ME;;Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD;;Rebecca L.Siegel MPH;;Lindsey A.Torre MSPH;;Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2018

[4]Xihuang pill promotes apoptosis of Treg cells in the tumor microenvironment in 4T1 mouse breast cancer by upregulating MEKK1/SEK1/JNK1/AP-1 pathway.Liang Su;;Yiming Jiang;;Yu Xu;;Xinye Li;;Wenbin Gao;;Chunwei Xu;;Changqian Zeng;;Jie Song;;Wencai Weng;;Wenbo Liang.Biomedicine&Pharmacotherapy,2018

[5]杨佳慧.丹栀逍遥散调控肿瘤相关成纤维细胞抑制乳腺癌生长、转移及分子机制[D].辽宁中医药大学,2021.