Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素)

背景^[1-6]

Puromycin Dihydrochloride(嘌呤霉素)是一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选通过质粒转染/转化、病毒感染等方法能表达pac基因(puror)的真核或原核多克隆或单克隆细胞。

Puromycin不仅用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。在革兰氏阳性菌、动物或昆虫细胞中，嘌呤霉素通过抑制蛋白质合成而抑制或杀死细胞。

其作用机制为嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3'末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素与A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

Pac基因表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，该基因是在Streptomyces alboniger中发现的。如果表达基因，就会对嘌呤霉素产生抗性，这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株等。例如，很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为puror)，从而利用嘌呤霉素筛选特定基因的稳定表达细胞株。嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。

研究应用^[7][8]

1.用于嘌呤霉素致足细胞损伤细胞模型的建立

建立小鼠足细胞损伤的细胞模型,为进一步从细胞、分子水平研究足细胞的生物学作用,以及足细胞特别是裂孔隔膜(slit diaphragm)分子在蛋白尿发生、发展中的分子机制提供稳定、可靠的足细胞损伤模型。

方法:应用不同浓度的嘌呤霉素(15mg/L、45mg/L和75mg/L)作用于足细胞,通过流式细胞仪检测作用24h和48h后足细胞的凋亡情况,以确定嘌呤霉素的作用浓度和时间,建立足细胞损伤的细胞模型;并以噻唑蓝(MTT)检测足细胞损伤后的活力,应用免疫荧光染色观察裂孔隔膜关键分子Nephrin、Podocin以及骨架蛋白F-actin在足细胞损伤中的分布来评价足细胞损伤。

结果:45mg/L嘌呤霉素作用48h以及75mg/L嘌呤霉素作用24h或48h,足细胞明显凋亡。结论:嘌呤霉素可以呈时间和剂量依赖性诱导小鼠足细胞凋亡,45mg/L嘌呤霉素作用48h后诱导的足细胞损伤模型稳定、可靠,可应用于足细胞损伤的研究。

2.用于嘌呤霉素损伤小鼠肾小球足细胞系中podocin表达与分布影响的研究

采用体外培养肾小球足细胞系,探讨足细胞损伤过程中,podocin mRNA表达和分布变化与足细胞损伤的关系。方法将体外培养的足细胞采用随机数字表法设立为实验组与对照组。实验组采用嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)刺激(剂量为50μg/mL),分别于8 h,24 h和48 h观察细胞形态、提取总RNA和细胞免疫组化观察podocin的分布。对照组用含10%FBS的RPMI 1640培养液培养。细胞图像应用Image J图像处理软件,计算实验组与对照组在上述各时间点200倍镜下随机选择的30个细胞的相对面积,半定量RT-PCR和间接免疫荧光法检测podocin mRNA表达和分布变化。

结果对照组呈星形伸出树枝状突起,相邻细胞间形成相互连接。实验组细胞体缩小,足突回缩、消失,细胞间失去相互连接。上述各时间点两组间podocin mRNA表达比较,差异无显著意义(P>0.05)。Podocin在对照组呈细丝状均匀分布于细胞核膜、细胞质及细胞膜;在实验组主要沿细胞核膜呈点线样分布,刺激后8 h和24 h细胞质有少许分布,刺激48 h后出现细胞膜、细胞质分布缺失。结论Podocin分布异常与足细胞损伤密切相关,损伤早期即有变化;podocin分布异常是足细胞损伤过程中的重要分子效应。

参考文献

[1] Pestka,S.(1971)."Inhibitors of ribosome functions".Annu.Rev.Microbiol.25:487–562.doi:10.1146/annurev.mi.25.100171.002415.PMID 4949424.

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[4] Dando,Pam M.;Young,Nina E.;Barrett,Alan J.(1997)."Aminopeptidase PS:a Widely Distributed Cytosolic Peptidase".In Hopsu-Havu,VäinöK.;Järvinen,Mikko;Kirschke,Heidrun.Proteolysis in Cell Functions.IOS Press.pp.88–95.ISBN 978-90-5199-322-6.

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[6] "Archived copy".Archived from the original on 2014-10-10.Retrieved 2014-05-11.

[7] 嘌呤霉素损伤小鼠肾小球足细胞系中podocin表达与分布的影响及其意义[J].温跃强,于力,温捷,郝志宏,陈蓉燕,王丽娜.中华妇幼临床医学杂志.2008(05)

[8] 嘌呤霉素肾病大鼠肾小球中nephrin、podocin和α-actinin与蛋白尿的关系[J].管娜,丁洁,张敬京,杨霁云.中华肾脏病杂志.2004(01)