人子宫内膜腺癌(转移)细胞的应用

背景^[1-3]

人子宫内膜腺癌(转移)细胞建系于1964年。它衍生于子宫内膜癌患者淋巴结转移组织，具有癌细胞的基本特性，能在体外长期传代培养，接种实验动物产生明显肿瘤。但细胞的生物学特性及超微结构尚未深入研究，仅发现该细胞系促黑激素合成为阴性。细胞常用于人子宫内膜癌细胞生物学及其相关特性研究。

人子宫内膜腺癌(转移)细胞

人子宫内膜腺癌(转移)细胞培养操作:

1)复苏人子宫内膜腺癌(转移)细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL人子宫内膜腺癌(转移)细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有人子宫内膜腺癌(转移)细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人子宫内膜腺癌(转移)细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人子宫内膜腺癌(转移)细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3min（视细胞消化情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若人子宫内膜腺癌(转移)细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将人子宫内膜腺癌(转移)细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人子宫内膜腺癌(转移)细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集人子宫内膜腺癌(转移)细胞及人子宫内膜腺癌(转移)细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据人子宫内膜腺癌(转移)细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人子宫内膜腺癌(转移)细胞可以用于人子宫内膜腺癌来源间充质干细胞的分离鉴定及生物学特性研究

分离培养并鉴定子宫内膜腺癌组织来源间充质干细胞(Endometrial adenocarcinoma derived Mesenchymal Stem Cells,ECMSCs),比较其与正常子宫内膜组织来源的间充质干细胞(Endometrium derived Mesenchymal Stem Cells,EMSCs)的生物学特性差异,为研究子宫内膜癌的发病机制、侵袭转移及对肿瘤微环境的影响提供理论与实验依据。

方法:1.无菌条件下获取子宫内膜腺癌组织,经Ⅱ型胶原酶消化后种植于培养瓶中,用含有10%FBS的α-MEM培养基培养,采用组织贴壁培养法培养子宫内膜腺癌组织来源MSCs,0.25%胰酶消化传代,同时取正常子宫内膜组织来源MSCs做对照培养。显微观察子宫内膜腺癌和正常子宫内膜组织来源MSCs细胞形态,瑞氏-姬姆萨染色观察细胞核质,CCK8法检测细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表型及细胞周期。诱导MSCs向脂肪、成骨细胞分化,通过油红O染色检测成脂诱导分化能力,碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色检测成骨诱导分化能力,并提取总RNA进行RT-PCR检测相关成脂成骨转录因子的相对表达量变化。

2. 对分离鉴定得到子宫内膜腺癌及正常子宫内膜组织来源MSCs进行免疫调节能力的检测,通过淋巴母细胞转化实验(Lymphocyte transformation test,LTT)和混合淋巴细胞反应实验(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)检测MSCs抑制T细胞增殖的免疫调节能力。并通过RT-PCR技术检测两种MSCs的免疫相关因子IL-6、IL-10、VEGF和TGF-β1的表达差异性。

结果:1.从子宫内膜腺癌组织中可培养出贴壁生长的成纤维样的细胞,细胞形态呈长梭状,旋涡状和放射状排布,原代生长缓慢,经α-MEM培养基培养传代后生长迅速,冻存复苏后仍保持较强的增殖能力;经CCK8法检测细胞增殖情况,绘制子宫内膜腺癌来源MSCs的细胞生长曲线,细胞呈“S”型曲线生长;流式细胞仪检测细胞周期,可见80%左右细胞分布在G0/G1期,检测相关细胞标记物,细胞表达CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC,不表达CD14、CD34、CD45、CD31、HLA-DR,提示分离得到的细胞符合MSCs的干细胞特征;此分离得到的细胞可经诱导成脂肪细胞,油红O染色可见有大量脂滴出现,RT-PCR检测可见脂肪分化关键转录因子PPAR-γ2的显著表达;经成骨诱导14天,可见碱性磷酸酶染色阳性,诱导28天Von-Kossa染色可见钙化骨结节形成;RT-PCR检测可见成骨关键转录因子Osteocalcin的表达,说明从子宫内膜腺癌组织中成功分离得到MSCs。

3. 对从子宫内膜腺癌组织中分离得到的MSCs的免疫调节功能进行检测。LTT结果显示子宫内膜腺癌组织来源MSCs能有效抑制经由Con A刺激的T淋巴细胞增殖,且随着MSCs数量的增加,其抑制能力逐渐增强,呈现剂量依赖效应;与之相近,MLR结果证实MSCs也可抑制异体淋巴细胞作为抗原刺激T细胞增殖的过程,且伴随MSCs用量增加,其抑制作用更显著。通过RT-PCR检测MSCs中各免疫因子表达情况,发现子宫内膜腺癌组织来源MSCs中IL-10、VEGF、TGF-β1的表达高于正常子宫内膜组织来源MSCs,且差异具有统计学意义(P<0.05),IL-6差异不具有统计学意义(P>0.05)。

结论:1.从子宫内膜腺癌组织中分离培养出MSCs,子宫内膜腺癌组织来源MSCs和正常子宫内膜组织来源MSCs形态主要以长梭形为主,呈旋涡状生长排布。

2. 子宫内膜腺癌组织来源MSCs表达CD73、CD90、CDCD105、CD166、HLA-ABC,不表达CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR,细胞周期及细胞表面标记物符合干细胞特征。

3.子宫内膜腺癌组织来源MSCs具有分化成脂肪及成骨细胞的能力,其成脂分化能力强于正常子宫内膜组织来源MSCs,差异有统计学意义(P<0.05)。

参考文献

[1]Gastric cancer-derived MSC-secreted PDGF-DD promotes gastric cancer progression[J].Feng Huang;;Mei Wang;;Tingting Yang;;Jie Cai;;Qiang Zhang;;Zixuan Sun;;Xiaodan Wu;;Xu Zhang;;Wei Zhu;;Hui Qian;;Wenrong Xu.Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,2014(11)

[2]A 9-protein biomarker molecular signature for predicting histologic type in endometrial carcinoma by immunohistochemistry[J].Maria Santacana;;Oscar Maiques;;Joan Valls;;Sònia Gatius;;Ana Isabel Abó;;Maríaángeles López-García;;Alba Mota;;Jaume Reventós;;Gema Moreno-Bueno;;Jose Palacios;;Carla Bartosch;;Xavier Dolcet;;Xavier Matias-Guiu.Human Pathology,2014

[3]Tumor Microenvironment and Metabolism in Prostate Cancer[J].Paola Chiarugi;;Paolo Paoli;;Paolo Cirri.Seminars in Oncology,2014

[4]Mesenchymal stem cells in lung cancer tumor microenvironment:their biological properties,influence on tumor growth and therapeutic implications[J].Renwang Liu;;Sen Wei;;Jun Chen;;Song Xu.Cancer Letters,2014(2)

[5]周向东.人子宫内膜腺癌来源间充质干细胞的分离鉴定及生物学特性研究[D].安徽医科大学,2016.