人非小细胞肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人非小细胞肺癌细胞是于1987年从一名27岁白人男性(10年烟龄)支气管肺泡癌患者的胸腔积液中分离得到的。

人非小细胞肺癌细胞

一．人非小细胞肺癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1)准备1640基础培养基：87%

特级胎牛血清：10%

GlutaMAX—I谷氨酰胺：1%

Sodium Pyruvate丙酮酸钠：1%

P/S青霉素-链霉素：1%

2)人非小细胞肺癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3)人非小细胞肺癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．人非小细胞肺癌细胞处理：

1）冻存人非小细胞肺癌细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）人非小细胞肺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人非小细胞肺癌细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若人非小细胞肺癌细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将人非小细胞肺癌细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）人非小细胞肺癌细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1.人非小细胞肺癌细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的人非小细胞肺癌细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4][5]

人非小细胞肺癌细胞可以用于血清饥饿诱导肺癌细胞NCI-H1650迁移和侵袭能力增强的机制研究

探究血清撤除对肿瘤细胞的形态、迁移能力和侵袭能力的影响,本实验在非小细胞肺癌NCI-H1650细胞上进行了血清饥饿实验。结果表明,血清饥饿处理后,NCI-H1650细胞在形态上由初始的上皮样变为成纤维样,且细胞运动能力、transwell迁移能力、侵袭能力均显著增强。而且,血清饥饿处理人非小细胞肺癌细胞NCI-H1650细胞后,再加入终浓度为2%FBS(Fetal Bovine Serum)进行培养,发现饥饿后呈成纤维样的细胞恢复为上皮样,运动迁移能力与体外侵袭能力都明显下降。

另外,为了探究血清饥饿处理引起的人非小细胞肺癌细胞NCI-H1650细胞迁移能力、侵袭能力提高是否跟EMT有关,本实验从蛋白水平、mRNA水平验证了EMT相关标志物的表达水平(Vimentin,Snail1,E-Cadherin),结果表明细胞在2%FBS的条件下,转录因子Snail1表达量较低,但在血清饥饿处理的细胞中表达量明显上调,加入2%FBS恢复后Snail1表达量又显著下调。

为了进一步明确Snail1是否在血清饥饿诱导NCI-H1650细胞运动侵袭能力增强的过程中发挥重要作用,本实验对人非小细胞肺癌细胞NCI-H1650细胞进行siRNA干扰实验,使Snail1基因沉默后再进行血清饥饿处理,结果显示,与对照相比,无论在含有2%FBS条件下或者血清完全撤除的条件下,Snail1敲低后形态和迁移能力均没有显著差异。

由此得出结论:饥饿刺激下诱导的迁移能力、侵袭能力的提高与EMT无关。为了找到调控血清饥饿促进NCI-H1650细胞运动侵袭的关键调控因子,本研究鉴定了应激信号传导相关通道,例如MAPK,并借助通路抑制剂进行药理学实验验证,最后发现在血清饥饿条件下,ERK蛋白磷酸化水平显著升高,从而使细胞形态发生改变,并促进细胞的侵袭和迁移。

参考文献

[1]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD;;Jacques Ferlay ME;;Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD;;Rebecca L.Siegel MPH;;Lindsey A.Torre MSPH;;Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2018(6)

[2]SPARCL1 suppresses the proliferation and migration of human ovariancancer cells via the MEK/ERK signaling[J].Yan Ma;;Yuan Xu;;Li Li.Experimental and Therapeutic Medicine,2018(4)

[3]Present and future of cancer immunotherapy:A tumor microenvironmentalperspective(Review)[J].Yu Yu;;Jiuwei Cui.Oncology Letters,2018(4)

[4]Mechanisms that drive inflammatory tumor microenvironment,tumor heterogeneity,and metastatic progression[J].Li Yang;;P.Charles Lin.Seminars in Cancer Biology,2017

[5]夏明.血清饥饿诱导肺癌细胞NCI-H1650迁移和侵袭能力增强的机制研究[D].深圳大学,2019.