Obatoclax Mesylate (Bcl-2抑制剂)

背景^[1-5]

Obatoclax甲磺酸盐，也称为GX15-070，是一种治疗各种癌症的实验药物。它是由Cephalon收购的Gemin X发现的，后来被Teva Pharmaceuticals收购。Obatoclax Mesylate可用于治疗白血病，淋巴瘤，骨髓纤维化和肥大细胞增多症。Obatoclax是BCL-2家族蛋白的拮抗剂。它与BCL-2结合的Ki为220 nM。Obatoclax（0,0.5,1,2.5,5和10μM）有效地消除了OCI-AmL3细胞的生长，并且在HL60，KG1和U937细胞中观察到类似的结果。

Obatoclax还显示低剂量抗增殖特性，伴随着S/G2细胞周期阻滞。在中和Mcl-1后，Obatoclax（10μM）诱导细胞凋亡通过内在的凋亡途径进行。Obatoclax与AraC和ABT-737协同诱导AmL细胞系中的细胞凋亡。Obatoclax（250 nM）诱导细胞凋亡并选择性抑制原代AmL细胞的集落形成。使用IC 50，Obatoclax诱导细胞死亡对K1，BCPAP和KTC-1细胞分别为3.18μM，0.85μM和0.76μM。Obatoclax还通过诱导混合细胞死亡形式，MOMP丧失，线粒体呼吸抑制和细胞糖酵解来增强Vemurafenib的细胞毒性。

Obatoclax调节authophagy的诱导和降解阶段，并促进K1细胞中Mcl-1/Beclin-1依赖性自噬。Obatoclax抑制细胞增殖并诱导一组人结直肠癌细胞系中的G1细胞周期停滞，并且IC 50对于HCT116，HT-29和LoVo细胞，72小时的细胞增殖分别为25.85,40.69和40.01nM。Obatoclax（0,25,50,100,200nM）下调细胞周期蛋白D1以诱导G1期停滞和随后的抗增殖。

Obatoclax（200 nM）靶向细胞周期蛋白D1，用于蛋白酶体介导的降解。Obatoclax（500 nM，1μM）诱导坏死细胞死亡并诱导自噬阻滞，与500 nM的细胞死亡无关。Obatoclax定位于溶酶体，影响溶酶体结构和性质，但不会引起大量溶酶体透化。在体内Obatoclax+Vemurafenib（20 mg/kg/天用于组合）可在甲状腺癌的皮下异种移植模型中更彻底地延缓肿瘤生长。Obatoclax（5 mg/kg，ip）可有效减少小鼠肿瘤的生长。

研究应用^[6]

Obatoclax Mesylate (Bcl-2抑制剂)可用于抗胰腺癌的活性研究。Bcl-2家族成员和PARP都与凋亡和DNA损伤修复有关。为了检测这种可能性，我们使用MTT法和流式细胞术来考察GX15-070和AZD2281单药及联合用药对6株表达不同水平的PARP1、Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1的胰腺癌临床相关细胞株ASPC-1,BxPC-3,CFPAC-1,HPAC,MIAPaCa-2,和PANC-1的抗肿瘤效果。这两种药都引起了细胞生长抑制，然而却只引起很有限的凋亡。而且，单药的敏感性看起来与PARP1、Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1蛋白水平无关。

当AZD2281与临床可使用浓度的GX15-070同时使用时，我们用CalcuSyn软件和标准等效线图解法分析，得到叠加到协同的抗肿瘤作用。同时用药相对于单独用药导致死亡细胞比例的显著升高。与此相似，用shRNA在胰腺癌细胞中沉默PARP1基因也显著增强了GX15-070引起的细胞死亡。

此外，AZD2281和GX15-070联合用药相对于单药处理更加显著地抑制了细胞集落的形成，而且CalcuSyn软件分析表明二者对细胞集落形成的抑制作用是协同的。然而，我们没有检测到割裂的caspase-3和PARP1，这预示GX15-070和AZD2281引起的细胞死亡是通过非凋亡性细胞死亡机制。与上述结果相一致，用PI染色和流式细胞术并未在联合用药处理过的胰腺癌细胞中检测到sub-G1期细胞比例的提高。

对BxPC-3细胞的细胞周期分析显示，AZD2281单药处理后有G2/M期的少量升高，加入GX15-070后G2/M期有进一步的显著升高，这一显著升高伴随着CDK1蛋白水平的降低。在PANC-1细胞中，我们检测到AZD2281单药处理后有S期的少量升高，加入GX15-070后S期有进一步的显著升高，并伴随着CDK2蛋白水平的少量降低。

这些结果进一步显示GX15-070并没有通过传统的凋亡机制来增强AZD2281的细胞毒性作用。联合用药处理相对于对照处理引起了Bcl-2水平的少量降低，这意味着药物诱导的非凋亡性细胞死亡可能是由于Bcl-2蛋白水平的降低而导致的。奇怪的是，在荷瘤裸鼠体内实验中，单药和联合用药处理并未导致显著的外部可测的肿瘤生长延迟，显示缺乏药物治疗反应。

然而，联合组血清的CA19-9（一个用来监测化疗应答的胰腺癌生物标志物）的水平与其它组相比显著降低，显示了治疗反应。H&E染色显示，与对照组相比，药物处理组的肿瘤坏死区增大，尤其是联合用药组的肿瘤坏死区增加更加显著。免疫组化的结果与H&E染色结果一致，联合组与其它组相比，PCNA和CD34的表达明显降低。

这些结果显示，GX15-070和AZD2281配合抑制了肿瘤中胰腺癌细胞的增殖和血管生成。综上所述，本论文的研究结果表明在临床前模型中，GX15-070和AZD2281对胰腺癌具有协同抗肿瘤活性。虽然还没有直接的证据，我们怀疑GX15-070主要通过抑制Bcl-2、Bcl-xL和/或Mcl-1非凋亡功能来增强PARP抑制剂AZD2281的细胞毒性作用。这个推断还需要进一步的研究来验证。

无论如何，我们的最新研究结果显示用GX15-070和AZD2281联合治疗胰腺癌可能具有临床益处。基于Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1在线粒体凋亡途经中所起的重要作用，GX15-070处理应该引起细胞凋亡。然而，在临床可达到的浓度下，GX15-070只引起少量的细胞凋亡，这意味着存在其它机制阻止GX15-070诱导胰腺癌细胞凋亡。

参考文献

[1].Marina Konopleva,et al.Mechanisms of Antileukemic Activity of the Novel Bcl-2 Homology Domain-3 Mimetic GX15-070(Obatoclax).Cancer Res May 1,2008 68;3413

[2].Wei WJ,et al.Obatoclax and LY3009120 Efficiently Overcome Vemurafenib Resistance in Differentiated Thyroid Cancer.Theranostics.2017 Feb 23;7(4):987-1001.

[3].Or CR,et al.Obatoclax,a Pan-BCL-2 Inhibitor,Targets Cyclin D1 for Degradation to Induce Antiproliferation in Human Colorectal Carcinoma Cells.Int J Mol Sci.2016 Dec 27;18(1).

[4].Champa D,et al.Obatoclax kills anaplastic thyroid cancer cells by inducing lysosome neutralization and necrosis.Oncotarget.2016 Jun 7;7(23):34453-71.

[5]. Nguyen M,et al.Small molecule obatoclax(GX15-070)antagonizes MCL-1 and overcomes MCL-1-mediated resistance to apoptosis.Proc Natl Acad Sci U S A.2007 Dec 4;104(49):19512-7.Epub 2007 Nov 26.

[6]. OBATOCLAX与OLAPARIB或氯喹协同抗胰腺癌的活性研究[D].陈绍华.吉林大学.2014