人肾上腺皮质小细胞癌细胞的应用

背景^[1-3]

人肾上腺皮质小细胞癌细胞是1971年8月从55岁的患有肾上腺皮质癌的白人女性患者中分离建立的。该患者的病理诊断为Ⅳ级肾上腺皮质原发性小细胞癌。电镜显示，该细胞有许多球形缝隙连接(BGJ)。

人肾上腺皮质小细胞癌细胞

人肾上腺皮质小细胞癌细胞培养步骤:

一.培养基及培养冻存条件准备:

1)准备DMEM-H培养基(DMEM-H:GIBCO,货号12800017,添加NaHCO3 1.5g/L),90%;胎牛血清,10%。

2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液:90%完全培养基,10%DMSO,现用现配。液氮储存。

二.细胞处理:

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:

1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时,弃去培养基后加入少量胰酶,细胞变圆脱落后,加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中,再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人肾上腺皮质小细胞癌细胞可以用于miR-205抑制肾上腺皮质癌的体外实验研究

肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma, ACC)是原发于肾上腺皮质的恶性肿瘤。ACC占恶性肿瘤的0.02%。ACC恶性程度高,侵袭性强,早期诊断困难,目前对其发生的病理学机制仍不明确,生物学方面早期容易出现转移和复发,平均生存期18个月。

构建了pcDNA3.1(+)-miR-205真核表达载体及合成miR-205反义核苷酸,调控SW-13细胞中miR-205表达,观察其对肾上腺皮质癌SW-13细胞增殖、凋亡和侵袭等影响。本研究有可能为ACC的发病机制及诊疗策略进一步提供新的思路和理论依据。

[方法]1.采用组织芯片平台,原位杂交技术检测ACC、肾上腺腺瘤及其正常对照组织中miR-205表达水平。

2. 通过基因重组技术构建pcDNA3.1(+)-miR-205重组质粒,通过Lipofectamine2000将pcDNA3.1(+)-miR-205转染肾上腺皮质癌SW-13细胞,上调miR-205在SW-13中的表达。合成miR-205的反义寡核苷酸并转染SW-13细胞,下调miR-205在SW-13细胞中表达。实时荧光定量PCR法验证miR-205在SW-13细胞中调控后表达水平。

3. 在上调和下调miR-205表达后,观察在ACC细胞株中细胞水平的功能研究：通过MTS、EdU实验观察细胞增殖；用PI标记流式细胞仪测量细胞周期；TUNEL染色标记凋亡细胞；划痕试验法观察细胞迁移能力；Transwell法观察细胞侵袭能力。

[结果]1.原位杂交试验结果表明,miR-205在ACC中表达明显低于肾上腺腺瘤组织及正常对照组织,miR-205在ACC、肾上腺腺瘤组织及正常对照组织中阳性率分别为26.6%、84.5%及90.8%,其表达差异有统计学意义(P<0.05)。

2. 实时荧光PCR提示,在转染pcDNA3.1(+)-miR-205及miR-205反义寡核苷酸后,SW-13细胞中miR-205分别上调了63.2倍(P=0.001)及下调了86.3%(P=0.002)。miR-205mRNA的表达量差异说明：SW-13细胞中已成功转染miR-205真核表达质粒和miR-205反义核苷酸。

3. 在肾上腺皮质癌SW-13细胞株中,上调或下调miR-205表达后,分别采用MTS、EdU、TUNNEL及Transwell小室法,检测过表达及抑制miR-205对SW-13细胞生物学行为的影响。MTS结果提示,在24、48、72和96h时pcDNA3.1(+)-miR-205组相对于pcDNA3.1(+)组,SW-13细胞增殖抑制率分别为(10.50±1.8)%,(23.67±4.8)%,(30.79±5.4)%和(38.34±6.2)%,P值分别为0.041,0.014,0.016及0.032；而anti-miR-205转染组SW-13细胞增殖速度明显快于空白对照组,在不同的时间段,增殖率分别提高了(25.31±3.2)%,(32.51±4.6)%,(40.15±4.1)%和(38.34±6.2)%,P值分别为0.032,0.026,0.022及0.013。

EdU结果显示,pcDNA3.1(+)-miR-205组与pcDNA3.1(+)组增殖率分别为(18±2)%和(36±4)%,P=0.002;anti-miR-205组和空白对照组增殖率为(49±5)%和(38±4)%,p=0.04;EdU检测细胞增殖结果进一步证实miR-205能够抑制SW-13细胞增殖。上调或下调miR-205表达后,流式细胞仪检测结果提示SW-13细胞周期G0/G1期、S期、G2/M期差异均有统计学意义(P<0.05)。

TUNNEL检测pcDNA3.1(+)-miR-205组与pcDNA3.1(+)组相比,SW-13细胞的凋亡数分别为(46±4)／视野和(25±3)／视野,P=0.0019；而anti-miR-205组相对空白对照组的凋亡数为(11±2)／视野和(24±3)／视野,P=0.0033,结果提示miR-205促进ACC SW-13细胞株的凋亡。

划痕实验结果提示,在6h、24h、48h时,pcDNA3.1(+)-miR-205组SW-13细胞迁移率为7.04%、33.93%和52.37%；pcDNA3.1(+)组为9.36%、44.82%和73.90%；anti-miR-205组为17.50%、68.52%和99.06%；空白对照组为12.17%、39.00%和72.02%.Transwell小室检测pcDNA3.1(+)-miR-205组与pcDNA3.1(+)组穿过小室膜数分别为(43±8)／视野和(120±15)／视野,P-0.0014;anti-miR-205组和空白对照组则分别为(120±15)/视野和(220±20)／视野,P=0.0019；结果提示miR-205能够增强ACC SW-13细胞株的迁移和侵袭能力。

[结论]成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205,为进一步研究miR-205在肿瘤中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。miR-205通过抑制SW-13细胞的增殖、侵袭能力,促进其凋亡改变等,发挥抑癌作用。miR-205有可能成为鉴别ACC和良性肾上腺皮质腺瘤的一个分子标记物,进而可能成为ACC生物治疗靶点提供依据。

参考文献

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