Platinum白金聚合酶标记法

发布日期:2019/12/30 8:29:01

概述^[1]

Platium Taq DNA Polymerase简称Taq酶,是最常用的DNA聚合酶之一。Platium Taq DNA Polymerase是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶,分子量是94kDa,是将Thermus aquaticus DNA Polymerase 的基因重组表达后,分离提取而得到的。

对PCR定量检测结果的影响^[1]

我们知道不同 PCR系统的检测极限也不相同：有灵敏度可达一个拷贝的；也有灵敏度只可达1000个拷贝的；还有更低的。但利用同一PCR检测系统，对PCR反应结果的影响因素就以 Taq酶为关键。

Taq 酶在 PCR 反应中所起的作用是利用其 3′→5′聚合酶活性以 DNA 为模板，将 dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到 3-OH 末端；同时利用其 5′→3′外切酶活性即能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关，又可以从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。由此在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。

Platinum白金聚合酶由水栖高温菌（Thermus aquatics）YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为70～75℃，有实验表明Platinum白金聚合酶活性在热启动以后的半衰期为：97℃时 20分钟、95℃时 40分钟、94℃时60分钟、92℃时 90 分钟。半衰期后 PCR 扩增效率迅速降低为接近零。

Platinum白金聚合酶标记法^[2]

为了探索低成本、高效、便捷、快速的DNA探针标记方法来代替Klenow片段标记法,作者改进了一种快速标记DNA探针的方法,即Taq酶标记法。该方法利用了Platinum白金聚合酶热稳定性好和合成速度快(1- 2 kbs)的特征,以PCR原理为基础而设计的。本研究以籼稻丝氨酸/苏氨酸激酶基因rSTK为例,以Klenow片段随机引物延伸法为对照,用随机引物和特定引物分别作为Platinum白金聚合酶标记法的延伸引物进行探针标记并利用点杂交检测了两种方法的标记效果。

Taq酶标记法:用随机引物和rSTK特定引物分别标记rSTK(图2)。反应体系:模板DNA 25 ng,2.5 mmol/L的dCTP,dGTP,dTTP和32P- dATP各2μL,10× PCR缓冲液5μL,25mmol/LMgCl24μL,Taq酶1μL(5个单位),50μmol/L随机引物(图3A)或rSTK特定引物(r5,r3)(图3B)1μL,加ddH2O至50μL。反应条件:95℃ 3min,室温1min,72℃ 2min,1- 3个循环。