脯氨酸脱氢酶抗体的应用

背景^[1-3]

脯氨酸脱氢酶抗体是一类可以特异性结合脯氨酸脱氢酶的多克隆抗体，主要用于体外检测脯氨酸脱氢酶的免疫学实验。

ProDH是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶。降低ProDH活性对于调节渗透平衡、防止渗透胁迫对植物造成伤害、清除自由基、保护细胞结构具有重要意义。

脯氨酸脱氢酶

ProDH催化脯氨酸脱氢生成延丙酮酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的下降，测定2,6-DCPIP的还原速度，代表ProDH活性。

脯氨酸（Proline，缩写为Pro或P），化学式为C5H9NO2，分子量为115.13，是一种环状的亚氨基酸。α-亚氨基酸，中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，25℃时100g水中可溶162 g左右。易潮解不易得结晶，有甜味。与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物。一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形成4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。羟脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关。在谷氨酰激酶(γ-GK)的作用下谷氨酸生成谷氨酰磷酸(γ-GP)，而后在谷氨酸一半醛脱氢酶(GSADH)的作用下生成谷氨酸一半醛(GSA)，GSA自发环化为吡咯琳-5-羧酸(P5C)，在吡咯琳-5-羧酸还原酶(P5CR)的作用下还原为脯氨酸。

脯氨酸在植物体内的降解基本上是合成过程的逆过程，这一过程首先发生在线粒体中，脯氨酸在线粒体中由脯氨酸脱氢酶(ProDH)催化，生成P5C，P5C在吡咯琳-5-羧酸脱氢酶(P5CDH)作用下生成谷氨酸，在植物受到渗透胁迫时，氧化降解的过程受到抑制，这样细胞中脯氨酸含量增加，植物复水，此过程又会被诱导，导致脯氨酸含量下降。植物体在干旱、高温、低温、盐渍等多种逆境下，常常有脯氨酸的明显积累。在临床、生物材料、工业等方面均有广泛应用

应用^[4][5]

脯氨酸脱氢酶抗体可以用于马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的克隆、表达分析及其dsRNA的发酵生产

铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因全长的克隆根据其他昆虫的脯氨酸脱氢酶基因保守域序列设计兼并引物,扩增出马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的中心区段,结合5’RACE和3’RACE技术获得该基因的1个5’端序列和3个3’端序列,经序列拼接获得3个长度分别为2509bp、3076bp、3231bp的脯氨酸脱氢酶可变剪接体,在GenBank中登录号分别为GU355892、GU355893、GU355894,依次定名为脯氨酸脱氢酶基因转录异型体-1、2与3。序列分析结果表明,这3个可变剪接体均包含1个的开放阅读框,编码616氨基酸,其理论上的等电点PI=8.87,相对分子质量为7.07×104,聚类分析显示其与已报道的其它昆虫的脯氨酸脱氢酶基因具有较高的氨基酸序列同源性。

马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的表达分析经过end-to-end PCR验证,进一步证实了马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶的3个转录异型体是确实存在的。以基因组DNA为对照,越冬前后的马铃薯甲虫cDNA为模板来研究脯氨酸脱氢酶的3个转录异型体在越冬前后表达丰度的差异。实验结果显示脯氨酸脱氢酶基因的3个转录异型体在越冬前都呈低水平表达,而脯氨酸脱氢酶基因转录异型体-1在越冬后优势转录表达。正常情况下,基因在3’UTR的序列越长,则其在细胞中的半衰期越短。这一结果表明,为了适应越冬后的长距离飞行需要,马铃薯甲虫通过缩短3’UTR序列长度的方式,达到延长脯氨酸脱氢酶mRNA半衰期进而来提高细胞中脯氨酸脱氢酶丰度的目的,以满足长距离飞行过程中高能量代谢的需求。

sid-1基因cDNA片段的克隆与进化分析通过生物信息学手段对NCBI EST数据库中类sid-1基因进行预测,而后选取几种重要农业害虫(马铃薯甲虫,灰飞虱,褐飞虱)的类sid-1基因进行RACE PCR克隆。在褐飞虱中得到1个1137bp的5‘端序列和1个1328bp的3‘端序列,拼接得到2786bp的cDNA全长序列；在灰飞虱中得到1个792bp的5‘端序列和1个1766bp的3‘端序列,拼接得到2515bp的cDNA全长序列；在马铃薯甲虫中得到1个350bp的5‘端序列。褐飞虱与灰飞虱类sid-1基因拼接序列的End-to-end PCR分别得到片段大小为2594bp与2322bp的产物,产物的测序结果与拼接得到的序列是一致的。与其他物种类sid-1基因构建的聚类树状图表明拼接马铃薯甲虫类sid-1基因cDNA片段与已报道的其它昆虫的类sid-1基因具有较高的氨基酸序列同源性,且与赤拟谷盗距离最近,推测马铃薯甲虫也具有类sid-1基因,具备系统性RNA干扰的前提条件。

参考文献

[1]To localize or not to localize:mRNA fate is in 3′UTR ends[J].Catia Andreassi;;Antonella Riccio.Trends in Cell Biology,2009(9)

[2]Widespread Shortening of 3′UTRs by Alternative Cleavage and Polyadenylation Activates Oncogenes in Cancer Cells[J].Christine Mayr;;David P.Bartel.Cell,2009(4)

[3]mRNA Localization:Gene Expression in the Spatial Dimension[J].Kelsey C.Martin;;Anne Ephrussi.Cell,2009(4)

[4]Colorado Potato Beetle Resistance to Insecticides[J].Andrei Alyokhin;;Mitchell Baker;;David Mota-Sanchez;;Galen Dively;;Edward Grafius.American Journal of Potato Research,2008(6)

[5]吕东.马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的克隆、表达分析及其dsRNA的发酵生产[D].南京农业大学,2010.