KCNA5抗体的应用

背景^[1-3]

KCNA5抗体是一种可以特异性结合KCNA5的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的KCNA5蛋白。KCNA5抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

KCNA5基因(Potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,member 5)编码的KCNA5通道(Kv1.5钾通道)介导了心房的超速激活延迟整流钾电流(ultrarapidly activating delayed rectifier potassium current,Ikur)。Ikur仅存在于心房肌,不存在于心室肌。由于房颤(atrial fibrillation,AF)的发生发展与心房Ikur的异常存在密切关系,因此目前认为KCNA5通道蛋白是治疗AF的一个理想靶点。FHL2由4个半LIM结构域组成,属于LIM-only蛋白家族,在FHL家族中有较为深入的研究。已知FHL2通过与转录因子、信号转导物和转录辅助因子等相互作用参与多种信号转录过程,且参与多种疾病的发生发展过程。

KCNA5抗体

KCNA5抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（KCNA5抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(KCNA5抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

KCNA5抗体可以用于KCNA5蛋白与FHL2蛋白的相互作用

运用KCNA5抗体免疫共沉淀和免疫荧光技术初步验证FHL2蛋白与KCNA5蛋白间的相互作用,为进一步研究对KCNA5蛋白功能表达的调节奠定基础。

方法:(1)质粒构建:以编码KCNA5的全长cDNA为模板,通过PCR方法在其开放读框的两端分别加上HindⅢ(5’端)和EcoRⅠ(3’端)两个酶切位点,去除末端的终止密码;应用HindⅢ和EcoRⅠ分别酶切pcDNA3.1/myc-His C质粒和PCR产物,应用DNA连接酶将线性的pcDNA3.1/myc-His C和PCR产物进行连接,得到pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5质粒。pcDNA3.0-FHL2由导师提供(已经测序鉴定)(。2)细胞培养和基因转染:培养HEK293细胞,应用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5质粒和pcDNA3.0-FHL2质粒共转染HEK293细胞。(3)免疫共沉淀:将抗FHL2特异性抗体和总蛋白进行混合,再加入Protein A/G Plus-Agarose进行混合,离心沉淀,将沉淀物进行电泳,随后应用抗Myc抗体进行Western Blot分析。(4)KCNA5抗体免疫荧光细胞化学分析:将质粒pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2共转染HEK293细胞,转染48小时后固定,应用抗FHL2一抗(羊来源)和Alexa 488标记的驴抗羊二抗检测FHL2蛋白,应用抗Myc一抗(兔来源)和Alexa 555标记的驴抗兔二抗检测KCNA5-Myc融合蛋白。结果:(1)成功构建pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5质粒,并经测序证明KCNA5编码的蛋白与载体的myc-His在同一读框,碱基无突变。(2)pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2质粒共转染HEK293细胞,提取细胞蛋白进行免疫共沉淀实验和Western Blot,实验组和阳性对照组均可见一条约75KD大小的条带,与KCNA5-myc-His融合蛋白大小相当,阴性对照组未见条带。(3)质粒共转染HEK293细胞,进行KCNA5抗体免疫荧光实验后,用倒置荧光显微镜观察可见在细胞膜上KCNA5蛋白和FHL2蛋白分别发出红色荧光和绿色荧光,二者荧光重叠部分(黄色荧光)提示这两种蛋白在细胞上共定位。

参考文献

[1]The multifunctional roles of the four-and-a-half-LIM only protein FHL2[J].M.Johannessen;S.M?ller;T.Hansen;U.Moens;M.Van Ghelue.Cellular and Molecular Life Sciences,2006(3)

[2]Proteomic resources:Integrating biomedical information in humans[J].Shubha Suresh;;S.Sujatha Mohan;;Goparani Mishra;;G.R.Hanumanthu;;M.Suresh;;Raghunath Reddy;;Akhilesh Pandey.Gene,2005

[3]Novel approaches to map protein interactions[J].Daniel Figeys.Current Opinion in Biotechnology,2003(1)

[4]Global approaches to protein–protein interactions[J].Gerard Drewes;;Tewis Bouwmeester.Current Opinion in Cell Biology,2003(2)

[5]武君.KCNA5蛋白与FHL2蛋白的相互作用[D].汕头大学,2010.