大肠杆菌耐热性肠毒素抗体的应用

背景^[1-3]

大肠杆菌耐热性肠毒素抗体是一类可以特异性结合大肠杆菌耐热性肠毒素的多克隆抗体，主要用于体外检测大肠杆菌耐热性肠毒素的免疫学实验。大肠杆菌耐热性肠毒素抗体是将纯化的大肠杆菌耐热性肠毒素对实验动物进行系统免疫后从其血液中分离纯化出的多可隆抗体。

肠毒素是一种外毒素，通常指金黄色葡萄球菌产生的一种相对热稳定的毒素。根据抗原性分为A-E，G-I 8个血清型。肠毒素是蛋白质，溶于水，相对分子质量约为30000，耐热（有一种大肠杆菌不耐热肠毒素新兴突变体），食品中的毒素不因加工而灭活；对蛋白酶与有耐性，故在消化道中不易被破坏。食入肠毒素可引起剧烈呕吐和腹泻，是葡萄球菌性食物中毒的主要致病因子。肠毒素有时也指专对肠粘膜细胞具有特殊毒性作用的毒素。肠组织产生的毒素。

大肠杆菌

人源ETEC是一类可分泌LT和/或STa的大肠杆菌，大部分菌株还会产生一个或多个CFs。CFs主要是菌毛状或纤丝状的生物多聚纤丝，每个菌体表面存在数百个这样的重复结构单元。至少有25种不同的CFs被证明与腹泻相关，其中7种常见于严重腹泻病例。这些CFs介导细菌黏附到宿主上皮细胞并定植于小肠，随后在小肠上皮细胞近端产生和释放LT和STa肠毒素，刺激体液过量分泌，引起腹泻。

应用^[4][5]

大肠杆菌耐热性肠毒素抗体可以用于产肠毒素大肠杆菌多价肠毒素疫苗的研究

耐热性肠毒素(ST)是ETEC的重要毒力因子,它是免疫原性很弱的小分子半抗原,如何将ST与大分子载体偶联使其具备良好的免疫原性并消除其天然毒性是ETEC疫苗研究中的难点。现有ETEC疫苗中均不含有ST组分,不能诱导有效的抗毒素免疫,因此免疫保护效果有待提高。为了获得更有效的ETEC疫苗,本论文的研究目的是将编码两种ST分子(STa、STb)的基因与不耐热肠毒素B亚基(LTB)的基因进行融合,进而制备3价融合ETEC肠毒素的DNA疫苗与蛋白疫苗,其特征是含有3种ETEC重要肠毒素毒力因子(分别为LTB、STa,STb)的抗原表位,能够引起抗3种肠毒素的特异性抗体反应,为机体提供全面的抗毒素免疫,从而提高ETEC疫苗的保护率。

主要工作如下：(1)多价肠毒素DNA疫苗的研究：应用重叠延伸PCR技术扩增获得了鸡胰岛素信号肽的基因ins和鸡尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活剂的信号肽基因upa,将肠毒素基因LTB、STa、STb及信号肽基因进行连接得到多价融合基因,在相邻的肠毒素基因之间设计了编码5-7个氨基酸的连接肽序列,将融合基因插入真核表达载体pCI,获得了3种多价肠毒素真核表达质粒pCI-ins-SLS、pCI-upa-SLS、pCI-SLS。经DNA测序证明,所构建的表达载体目标基因序列正确。利用柱层析法纯化DNA疫苗,经脂质体介导转染体外培养的Hela细胞进行瞬时表达实验,免疫荧光实验的结果表明所构建的真核表达质粒能够表达目的重组蛋白。用3种DNA疫苗免疫产蛋母鸡,ELISA测定表明获得了LTB特异性抗体,但STa及STb特异性抗体的效价较低；用其中不带信号肽的DNA疫苗pCI-SLS免疫小鼠,获得了高水平的抗LTB、STa及STb的特异性血清抗体,该抗血清具有中和STb毒性的活性,但没有STa的中和活性,在小鼠攻毒保护实验中提供了50%的保护率,与对照组相比有显著差别(P<0.05)；

（2）多价肠毒素蛋白疫苗的研究：首先利用PCR法扩增获得了三种肠毒素LTB、STa、STb的编码基因,应用“限制性内切酶酶切-连接酶连接”等基因工程手段将肠毒素基因LTB、STa、STb进行连接得到三价融合基因LTB-STa-STb,每两段相邻的基因之间设计了编码7个氨基酸的连接肽序列。又以质粒pCI-SLS为模板扩增得到了三价融合基因STa-LTB-STb。将融合基因克隆入原核表达载体pET-30a,获得了2种三价肠毒素原核表达质粒pET30-LSS和pET30-SLS,转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中后经诱导剂IPTG诱导,聚丙烯酞胺凝胶电泳及蛋白质免疫印迹检测实验表明成功的表达了重组三价肠毒素融合蛋白LSS和SLS,分子量均为21 kDa。使用镍离子琼脂糖凝胶色谱柱进行亲和层析,获得了纯化的重组三价肠毒素蛋白。

用两种三价肠毒素蛋白疫苗免疫母鸡及小鼠,通过ELISA法检测抗体效价,结果表明在两种动物都获得了较高水平的抗LTB、STa及STb免疫反应,多价抗毒素能够中和STa及STb的毒性,在小鼠攻毒保护实验中提供了50-70%的保护率,与对照组相比有显著差别(P<0.05)。

参考文献

[1]Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli[J].Svennerholm;;Tobias.Expert Review of Vaccines,2008(6)

[2]Mice protected by oral immunization with Lactobacillus reuteri secreting fusion protein of Escherichia coli enterotoxin subunit protein[J].Chi‐Ming Wu;;Tung‐Ching Chung.FEMS Immunology&Medical Microbiology,2007(3)

[3]Enterotoxigenic Escherichia coli in veterinary medicine[J].Béla Nagy;;Péter Zs.Fekete.International Journal of Medical Microbiology,2005(6)

[4]Prevalence of Enterotoxigenic Escherichia coli-associated Diarrhoea and Carrier State in the Developing World[J].Christine Wenner?s;;Valdemar Erling.Journal of Health,Population and Nutrition,2004(4)

[5]尤建嵩.产肠毒素大肠杆菌多价肠毒素疫苗的研究[D].大连理工大学,2011.