大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M-ACHR)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M-ACHR)ELISA KIT用于检测血液、血清、胸腹水等其他体液中大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M-ACHR)的含量。

实验原理：大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M-ACHR)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M-ACHR)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M-ACHR)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M-ACHR)ELISA KIT

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M-ACHR)ELISA KIT用于脊髓毒蕈碱型乙酰胆碱受体介导吗啡依赖的机制研究

探讨毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptor)在吗啡依赖过程中的作用机制，本研究从脊髓水平分析吗啡依赖过程中m1-5的表达特征，观察了侧脑室或鞘内注射m1-5特异性反义寡脱氧核苷酸(A-olig)对吗啡戒断症状的影响，明确介导吗啡依赖过程的毒蕈碱受体亚型。

通过分析吗啡依赖过程中M受体对脊髓一氧化氮途径、肾上腺素能途径和谷氨酸-NMDA受体途径等的调节，并观察鞘内注射m受体亚型A-olig对导水管周围灰质区(PAG)谷氨酸释放以及对脊髓m(1-5)、nNOS、NR1A和α2基因表达的影响，从而探索M受体调节吗啡依赖的作用途径和神经生物学机制。还观察鞘内注射GDNF、BDNF或NGF的A-olig对吗啡戒断反应的影响，以探讨吗啡依赖与神经元的适应。

方法：逐日递增吗啡剂量建立大鼠吗啡依赖模型，戒断症状评分根据纳洛酮注射后1h内的各项症状的分值；观察鞘内注射M受体拮抗剂、NMDA受体拮抗剂、NOS抑制剂、可透过细胞膜的PKA激活剂、抑制剂以及蛋白磷酸酶抑制剂等对吗啡戒断症状的影响；应用lipofectin AMINE转染nNOS、eNOS、m1-5、NR1A、a2、GDNF、BDNV和NGF的A-olig，观察这些基因的A-olig对吗啡戒断症状的影响。应用比色法测定NO含量，利用酶促动力反应测定NOS活力，鸟苷酸环化酶的基础活力测定根据酶催化底物GTP生成cGMP含量计算，微透析样品的谷氨酸浓度测定应用FITC衍生标记产生荧光物质，然后用高效毛细管电泳激光诱发荧光测定。

应用高效液相色谱仪测定去甲肾上腺素含量，腺苷酸环化酶活力根据酶催化底物ATP生成cAMP含量计算；放射免疫法测定cAMP和cGMP的含量；PKA活力的测定根据有无cAMP存在情况下，γ-32P-ATp中的32P掺入组蛋白的量的差异来计算酶活力。以β-actin mRNA为内标，RT-PCR方法检测m1-5、nNOS、iNOS、eNOS、NR1A、NR2A和α2的mRNA，并进行半定量分析。

结果：鞘内或腹腔注射纳洛酮激发吗啡大鼠戒断症状的各项评分值之间没有明显差异，腹腔或鞘内注射东莨菪碱或pirenzepine均明显减轻吗啡戒断症状。

参考文献

[1]Auricular Intradermal Acupuncture as a Supplementary Motor Rehabilitation Strategy in Poststroke Patients:A Randomized Preliminary Clinical Study.[J].Miao Dan;;Lei Kuok-Tong;;Jiang Jing-Feng;;Wang Xin-Jun;;Wang Hong;;Liu Xiao-Ru;;Zhang Jia-Jia;;Xiong Jia-Wei.Evidence-based complementary and alternative medicine:eCAM,2020

[2]Somatotopic Organization and Intensity Dependence in Driving Distinct NPY-Expressing Sympathetic Pathways by Electroacupuncture[J].Shenbin Liu;;Zhi-Fu Wang;;Yang-Shuai Su;;Russell S.Ray;;Xiang-Hong Jing;;Yan-Qing Wang;;Qiufu Ma.Neuron,2020

[3]Muscarinic M1 and M2 receptor subtypes play opposite roles in LPS-induced septic shock[J].Zhen Wang;;Mingyi Li;;Lu Liu;;Bin Geng.Pharmacological Reports,2019(6)

[4]Auricular Electroacupuncture for Late Posttraumatic Epilepsy after Severe Brain Injury:A Retrospective Study.[J].Shen Cui-Cui;;Jiang Jin-Feng.Evidence-based complementary and alternative medicine:eCAM,2019

[5]周文华.脊髓毒蕈碱型乙酰胆碱受体介导吗啡依赖的机制研究[D].中国协和医科大学,2001.