长链脂肪酸酰基辅酶A水解酶抗体的应用

背景^[1-3]

长链脂肪酸酰基辅酶A水解酶抗体是一类可以特异性结合长链脂肪酸酰基辅酶A水解酶的多克隆抗体，主要用于体外检测长链脂肪酸酰基辅酶A水解酶的免疫学实验。

血脂谱反映了全身性脂肪组织炎的严重程度，患病个体和健康个体之间的脂质差异显著。在受上皮炎影响的脂肪组织中，与炎症，细胞死亡和/或氧化损伤相关的13种以上脂质发生上调，其中包括醚脂质，短链甘油三酯氧化产物，鞘脂和酰基肉碱。神经酰胺在发病最严重的脂肪组织中增加了1000倍，并且对疾病的严重程度敏感。在血浆中，发现甘油三酯在发病鱼中下调。本文中完整的脂质组学提供了有用的数据和全身性脂肪炎生物标志物。由于脂质组学的有助于解释可能的疾病机制，因此脂质组学可以用于了解其他环境衍生的炎症状况。

长链脂肪酸酰基辅酶A水解酶

长链脂肪酸酰基辅酶a合成酶(ACSLs)是合成脂肪酸酰基辅酶a的必需酶。ACSL1在甘油三酯、磷脂和胆固醇酯的合成中起关键作用。ACSL1产生的脂酰辅酶a参与了双甘油酯合成途径，过表达ACSL1时，双甘油酯含量明显升高。此外，绵羊脂肪细胞花生四烯酸(AA)含量显著增加，下游代谢基因环氧合酶2(COX2)表达水平显著下调。ACSL1基因的敲除与COX2 mRNA表达的增加以及AA的下游代谢物前列腺素含量的增加有关。ACSL1基因过表达通过下调COX2基因表达促进AA的产生。

应用^[4][5]

长链脂肪酸酰基辅酶A水解酶抗体用于三角褐指藻LACS酶在脂肪酸代谢中功能的初步研究

以富含LC-PUFA的海洋微藻-三角褐指藻为对象,采用分子生物学和生化等方法研究五个长链脂肪酸酰基辅酶A水解酶（ptACSL1-5）的生化特性。

主要研究结果如下:（1）采用逆转录PCR扩增长链脂肪酸酰基辅酶A水解酶1-4编码基因,分别构建ptACSL1-4与GFP的融合表达质粒,转化三角褐指藻,通过观察GFP荧光确定其亚细胞定位。结果表明:ptACSL1、ptACSL2和ptACSL3定位于质体,ptACSL4定位于细胞质膜和细胞质,而ptACSL5已知定位于过氧化物酶体。进一步通过GFP自组装方法确定了ptACSL1在质体中的具体定位:ptACSL1蛋白N端跨膜区位于叶绿体内质网（chloroplast ER）膜上,而C端位于胞浆。

（2）通过体外酶活实验研究了ptACSL1-5蛋白的底物特异性。分别构建ptACSL1-5蛋白C末端融合6×His标签的表达质粒并转化到大肠杆菌进行异源表达,使用亲和层析方法分别纯化得到对应ptACSL重组蛋白,在体外酶反应体系中以不同游离脂肪酸为底物采用NADH消耗法测定重组蛋白的酶活。结果表明:以C18:1为底物时,五个ptACSL蛋白都检测到较高的酶活（175.50-330.38 nmol/min/mg）;分别以五种不同脂肪酸为底物时ptACSL1和ptACSL2都能检测到酶活;以C20:5为底物时,ptACSL1和ptACSL4的酶活相对其它底物高2个数量级,分别高达3135.05 nmol/min/mg和2388.8 nmol/min/mg。

（3）采用Western blot方法研究了在缺氮培养和不同CO2浓度（空气、1%、4%、10%）培养条件下ptACSL1-5蛋白的表达模式。缺氮72 h内,ptACSL1、ptACSL3和ptACSL4蛋白表达持续上调,而ptACSL2蛋白表达下调。随着CO2浓度的提高,ptACSL1、ptACSL2和ptACSL4蛋白表达量降低;CO2浓度从空气提高至4%时,ptACSL3表达量明显增加,CO2浓度进一步增加至10%则抑制其表达。

（4）采用CRISPR/Cas9技术分别构建ptACSL1-5基因敲除突变株。分别根据五个ptACSL基因序列各设计6个sgRNA,并构建相应CRISPR/Cas9质粒。以转化子基因组DNA为模板采用巢式PCR检测并对gRNA敲除位点区域进行测序。结果表明突变类型均为片段缺失,缺失片段大小为67-733bp,单基因突变率约为33-70%,每个ptACSL基因选取3-5个突变株用于后续分析。综上所述,本论文对三角褐指藻的五个ptACSL蛋白的亚细胞定位、底物特异性、表达模式进行了研究,并构建了ptACSL1-5基因敲除突变株,为后续阐明长链脂肪酸酰基辅酶A水解酶1-5在脂肪酸代谢途径中的分子调控功能奠定了基础。

参考文献

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[5]郝夏晖.三角褐指藻LACS酶在脂肪酸代谢中功能的初步研究[D].中国农业科学院,2020.