纤维蛋白原的应用

背景及概述^[1][2]

纤维蛋白原即凝血因子Ⅰ，是凝血系统中的“中心”蛋白质，在凝血的最后阶段经凝血酶作用转变为纤维蛋白。纤维蛋白原是血浆中含量最高的凝血因子，浓度为2.0～4.0g/L。它是一种大分子糖蛋白，分子量为340kD，由两个相同的组分组成对称性二聚体，其中每个组分又各含有3条不同的多肽链，分别为A_α、B_β和γ。纤维蛋白原是不均一性蛋白质，有分子量为340kD、305kD、320kD的纤维蛋白原，而其中340kD者占70%左右。纤维蛋白原除作为凝血因子Ⅰ直接参与凝血过程外，还具有其他多种功能，如与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa结合而介导血小板聚集反应，参与动脉粥样硬化及肿瘤血行转移等。纤维蛋白原水平还影响血液黏度，近年来的研究发现血浆纤维蛋白原水平升高是心、脑血管血栓性疾病发病的重要危险因素。

结构^[1]

纤维蛋白原是一种含2 964 个氨基酸的大分子糖蛋白，相对分子质量为340 ×10³，首先在肝细胞中合成，由两个相同的组分(Aα，Ββ，γ)2 组成六聚体，链间以二硫键相连。Aα，Ββ，γ 三条多肽链借助AαCys28、γCys8 和Cys9 构成对称性二聚体。单体中AαCys36 与另一单体ΒβCys65 组成的二硫键对形成二聚体分子也起到关键作用。Aα、Ββ、γ三条多肽链相对分子质量分别为66 ×103、52 ×103 和46 ×103，并分别由610 个、461 个和411 个氨基酸残基组成。三条链在肝脏由独立的多核糖体合成其前体蛋白(分别包括19、30、26 个信号肽)，在粗面内质网内将信号肽切除、疏水反应及二硫键形成等加工后，折叠、装配成成熟的二聚体分子，最后经糖基化、部分磷酸化分泌到胞外。在成熟的纤维蛋白原二聚体分子中，中央区(E区)由6 条多肽链的氨基端组成，形成二硫键结；两个外围区(D 区)由Ββ 和γ链的羧基端组成，而Aα链的羧基端折回参与E 区结构。E 区和D 区之间由带状结构(coiled-coil)相连，coiled-coil 区为Aα、Ββ、γ三链形成的α-螺旋结构，大约由110 个氨基酸残基组成，coiled-coil 区两端的二硫键对纤维蛋白原分子成熟二聚体结构的形成至关重要。coiled-coil 区近氨基端部分的缺失对杂聚体和半分子的形成几乎没有影响，但会阻止半分子形成成熟的六链分子；相反此区远氨基端部分的缺失则会完全终止装配过程。用幼鼠肾细胞株(BHK)转染实验显示，纤维蛋白原的起始装配包括αγ和βγ杂聚体的形成，但不包括αβ 杂聚体，第三条链的加入导致半分子αβγ的形成，而后二聚化形成成熟的六链的纤维蛋白原，参与血液循环。

纤维蛋白原分子中，有多个配体的结合位点，研究较多的是凝血酶作用位点和血小板糖蛋白IIb/IIIa的结合位点。凝血酶的裂解位点在Aα-16 和Ββ-14，作用后分别释放出纤维蛋白肽A 和B，并同时分别形成纤维蛋白单体Ⅰ和。研究发现，Fg 中有多个糖蛋白Ⅱb/ Ⅲa 的结合序列，主要是α95 ～ 97、α572 ～ 574 的RGD 序列和γ400 ～ 411 附近的10 ～ 15 个氨基酸残基；并且两个多肽会相互抑制，说明两者在糖蛋白上的结合位点可能相同，也或是前者结合后导致糖蛋白构型的改变，而阻止另一种多肽的再次结合。其中γ400 ～411 是血小板聚集的关键，α链的RGD 序列则不是必需的。由于Fg 的3 条多肽链是独立合成的，成熟之前要经过加工和装配；每条多肽链的部分氨基酸的改变都可能影响这些过程，使3 条多肽链不能装配成完整的Fg 分子。除了前述的二硫键的重要作用外，β 链的合成是装配的限速步骤，特别是Ββ73 ～ 93 之间是装配所必需的；γ链的羧基末端氨基酸143 ～ 411，特别是γ387 也是关键。

生理功能^[1]

纤维蛋白原主要是作为凝血因子Ⅰ 而直接参与凝血过程。在凝血共同途径中，凝血酶先裂解纤维蛋白原两条Aα链氨基端Arg16-Gly17 释放出一对纤维蛋白肽A，形成纤维蛋白单体Ⅰ；在裂解纤维蛋白原两条Bβ 链氨基端Arg14-Gly15 释放出一对纤维蛋白肽B，形成纤维蛋白单体Ⅱ，暴露纤维蛋白单体的聚合部位，通过非共价结合，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单体。在活化的凝血因子 及Ca2+的作用下，纤维蛋白单体互相交联，生成稳定的可溶性纤维蛋白，并将血液的有形成分包绕其中，形成牢固的血栓。Fg 除参与凝血外，还具有其他多种功能，如与血小板膜糖蛋白Ⅱb/ Ⅲa 结合而介导血小板聚集反应，参与动脉粥样硬化及肿瘤血行转移等；纤维蛋白原水平还影响血液粘度，尤其近年来人们发现血浆纤维蛋白原水平升高是心脑血管、血栓性疾病的重要危险因素。血浆纤维蛋白原也是急性时相蛋白，在很多应激状况下，如感染、严重外伤等也可短时间内升高。

应用^[3]

纤维蛋白原临床用于先天性纤维蛋白原减少或缺乏症、获得性纤维蛋白原减少症、严重肝脏损伤、肝硬化、弥散性 血管内凝血、产后大出血、因手术或外伤或内出血等引起的 纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍。使用前先将本品及灭菌 注射用水预温至30～37℃，然后按瓶签标示量注入预温的灭 菌注射用水，置30～37℃水浴中，轻轻摇动使制品全部溶解 (切忌剧烈振摇以免蛋白变性)。用带有滤网装置的输液器进 行静脉滴注。滴注速度一般以每分钟60滴左右为宜。用量根 据病情及临床检验结果决定，一般首次给1～2g。

注意事项^[3]

1. 少数过敏体质患者会出现过敏反应、用药过量有引起血栓的危险性。

2. 本品溶解后为澄清略带乳光的溶液，允许有少量细小的蛋白颗粒存在，为此用于输注的输血器应带有滤网装置，但如发现有大量或大块不溶物时，不可使用。

3. 在寒冷季节溶解本品或制品刚从冷处取出温度较低的情况下，应特别注意先使制品和溶解液的温度升高到30～ 37℃，然后进行溶解。温度过低往往会造成溶解困难并导致蛋白变性。

相关疾病^[1]

已发现Fg 几十个多态性位点，其中对β 链基因的多态性研究较多，如-455G/A (Hae 位点)、-854G/A、-148C/T、-249C/T、-993C/T 等，特别是前两者可能与血浆纤维蛋白原的水平有关。-455G/A 的等位子A的频率从17 %到27 %不等，纯合AA 基因型有更高的血浆纤维蛋白原水平，但与深静脉血栓的发生无关。研究发现，一种相对分子质量为47 ×103 的蛋白质在转录起始阶段与此位点结合，并且与GG 纯合子结合的强度大于AA，这可能导致两种多态的转录效率不同，因而使AA 等位子的血浆蛋白原水平较高。但总体上，对这些多态位点与心血管疾病的关系仍有争论，FGB 基因的bcl 多态位点与缺血性心脏病的关系已被一些研究所证实；相反只有少数研究说明-455G/A 与之有关(5/14)。除考虑基因水平的影响外，还应注意纤维蛋白原水平与性别、吸烟和体活动的关系，以及环境-基因的相互作用。临床上可将纤维蛋白原疾病分为纤维蛋白原数量异常和功能异常两类。数量异常指纤维蛋白原分子完全消失(无纤维蛋白原血症，afibrinogenemia)或水平降低(低纤维蛋白原血症，hypofibrinogenemia)；功能异常是由于机体合成异常的纤维蛋白原分子所致(异常纤维蛋白原血症)。遗传性纤维蛋白原减低和功能异常时，纤维蛋白原基因都是存在的，但是纤维蛋白原的合成、分泌或最终产物的细胞内处理都存在异常。

遗传性无纤维蛋白原血症是一种非常罕见的疾病，自1920 年首次病例报道以来，已大约发现了150例病例。遗传性低纤维蛋白原血症于1935 年首次报道，目前文献中共报道了约40 例，但是有可能很多所谓低纤维蛋白原血症实际上都是伴有循环纤维蛋白原减低的异常纤维蛋白原血症。导致无纤维蛋白原血症最常见的基因缺陷是FGA 基因IVS4 +1G >T的剪接突变，即FGA 基因4 号内含子的个碱基G替换为T，从而改变4 号内含子5′剪接点的保守序列，影响其与U1snRNP 的结合，最终导致FGA 基因的异常剪接。虽然无纤维蛋白原血症患者的血液不能正常凝固，但是临床出血要比血友病轻得多，甚至很少发生出血。其机制仍有待于阐明。例异常纤维蛋白原血症于1965 年首次报道，截止目前共发现了约200 个患有该疾病的家系。纤维蛋白原的功能异常涉及纤维蛋白形成和稳定的所有重要步骤。将纤维蛋白原转化为不可溶的纤维蛋白多肽首先需要凝血酶将纤维蛋白原裂解，释放出纤维蛋白多肽A 和B，产生纤维蛋白单体，纤维蛋白单体再进行多聚化。因子 a 可以稳定多聚化的纤维蛋白。异常纤维蛋白原血症是由于可溶性纤维蛋白原向不可溶的纤维蛋白转化的过程发生了障碍。最常见的缺陷是纤维蛋白多聚化缺陷。有些异常纤维蛋白原血症患者产生的纤维蛋白不能被纤溶过程所溶解，这部分患者表现为发生血栓性疾病的倾向。异常纤维蛋白原血症是常染色体显性遗传性疾病，具有很高的外显率，绝大多数为杂合子。约40 %无症状，45 % ～ 50 %的病例表现为出血性疾病，而其余患者表现为血栓性疾病，或同时表现为出血和血栓形成的倾向。另外还有自发性流产、伤口愈合不良等临床表现。

制备^[4]

一种纤维蛋白原的制备方法，依次包括以下几个步骤：

(1)向血液中加入抗凝剂；

(2)离心分离，取上清抗凝血浆；

(3)对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入助剂，再加入磷酸三丁酯和吐温‑80作为病毒灭活剂，进行S/D病毒灭活；将灭活后的血浆离心分离，弃去沉淀物，取清液；

(4)一次沉降：将步骤(3)所得清液预冷至0～4℃，进行离心分离，弃去沉淀物，取清液加入冷乙醇，沉降血浆中的纤维蛋白原，所述冷乙醇的温度为‑20℃；

(5)分离并收集步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物，用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4) 中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；

(6)一次溶解：对步骤(5)中洗涤后的纤维蛋白原一次沉淀物加入一次溶解剂和助剂，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将步骤(5) 收集得到的纤维蛋白原一次沉淀物溶解，去除不溶物，收集一次溶解清液；该助剂与病毒灭活剂的助剂相同。因为一次溶解后还要加乙醇沉降，加入助剂也是为了保护凝血因子。

(7)二次沉降：将步骤(6)得到的一次溶解清液预冷至0～4℃后，向一次上清液中加入冷乙醇沉降一次溶解清液中的纤维蛋白原，所述冷乙醇的温度为‑20℃；

(8)分离并收集步骤(7)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀 物，用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4) 中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；

(9)二次溶解：对步骤(8)中洗涤后的的纤维蛋白原二次沉淀物 加入二次溶解剂，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将纤维蛋白原二次沉淀物溶解，去除不溶物，收集二次溶解清液；

(10)向步骤(9)得到的二次溶解清液中加入冻干保护剂，冻干，得到纤维蛋白原冻干制品。

主要参考资料

[1] 人纤维蛋白原的研究进展

[2] 内科学·卷 

[3] 临床处方药物手册

[4] CN201110188019.X 纤维蛋白原的制备方法