小鼠CD19分子(CD19)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠CD19分子(CD19)ELISA KIT可以检测血清、血浆、组织中CD19分子(CD19)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中CD19分子(CD19)水平。用纯化的CD19分子(CD19)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入血栓调节蛋白(TM)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的血栓调节蛋白(TM)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中CD19分子(CD19)含量。

鼠CD19分子(CD19)ELISA KIT

小鼠CD19分子(CD19)ELISA KIT操作步骤

标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于应用表达人CD19分子和luciferase的EG7细胞构建小鼠淋巴瘤模型的实验研究

为进一步明确表达抗人CD19-CAR新型效应细胞的抗肿瘤作用,阐明其直接抗肿瘤或与其他免疫细胞协同抗肿瘤的作用机制,拟构建能够稳定表达人CD19分子及用于监测肿瘤生长的luciferase的小鼠淋巴瘤EG7细胞,应用免疫功能正常的野生型C57BL/6小鼠建立淋巴瘤模型,为阐明来源于小鼠的抗人CD19-CAR-新型效应细胞在淋巴瘤中的作用及机制奠定基础。

研究方法:（1）构建含有人CD19分子以及luciferase的基因载体,通过慢病毒转染方式感染小鼠野生型EG7淋巴瘤细胞,获得稳定表达人CD19分子和luciferase的EG7细胞。

（2）将构建成功的稳定表达人CD19分子和luciferase的EG7细胞经皮下接种给C57BL/6小鼠,监测小鼠体重、肿瘤生长;小动物活体成像仪检测小鼠体内表达人CD19分子和luciferase的EG7肿瘤细胞增殖和分布情况;应用流式细胞仪对小鼠外周血、脾脏、淋巴结、骨髓以及肿瘤组织中肿瘤细胞及各种免疫细胞比率进行检测。

（3）将构建成功的稳定表达人CD19分子和luciferase的EG7细胞经腹腔接种给C57BL/6小鼠,监测小鼠体重、肿瘤生长;小动物活体成像仪检测小鼠体内表达人CD19分子和luciferase的EG7淋巴瘤细胞的增殖和分布情况;应用流式细胞仪对小鼠外周血、脾脏、淋巴结、骨髓以及肿瘤组织中肿瘤细胞及各种免疫细胞比率进行检测。

研究结果:（1）成功构建可稳定表达人CD19分子以及luciferase的小鼠淋巴瘤EG7细胞。

（2）稳定表达人CD19分子以及luciferase的EG7细胞可以在免疫系统健全的C57BL/6小鼠皮下形成肿瘤,肿瘤大小及成瘤率与接种细胞数量呈现正相关的关系;肿瘤组织中人CD19分子表达降低,但肿瘤组织内各种免疫细胞的比例与对照组相比没有显著变化。

（3）腹腔接种稳定表达人CD19分子以及luciferase的EG7细胞可以在免疫系统健全的C57BL/6小鼠的肠系膜以及肠壁处形成肿瘤,但流式细胞术未检测到肿瘤细胞表面人CD19分子的表达。

研究结论:（1）应用稳定表达人CD19分子以及luciferase的EG7细胞,通过皮下接种的方法可以建立免疫系统健全的C57BL/6小鼠淋巴瘤模型,用于研究正常免疫环境下抗人CD19-CAR-新型效应细胞的抗肿瘤作用及与其他免疫细胞相互作用的机制。

（2）腹腔接种稳定表达人CD19分子以及luciferase的EG7细胞可在小鼠肠系膜及肠壁处形成肿瘤,但未检测到肿瘤细胞表达人CD19分子,腹腔构建淋巴瘤模型的条件还需要进一步摸索和优化。

参考文献

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