人免疫核糖核酸(IRNA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人免疫核糖核酸(IRNA)ELISA KIT用于测定血清，血浆及相关液体样本中免疫核糖核酸(IRNA)的含量及活性。

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

人免疫核糖核酸(IRNA)ELISA KIT

操作步骤

1.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2..温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3..配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

4..洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5..加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6..温育：操作同3。

7.洗涤：操作同5。

8.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

9.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

10.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于抗肝癌免疫核糖核酸整体扩增技术的建立及抗肝癌作用研究

针对AT-iRNA中活性mRNA含量较少,从而影响治疗效果的问题出发,结合mRNA体外整体扩增技术,参照RNA疫苗制备研究中mRNA整体扩增流程,建立针对AT-iRNA中mRNA大量扩增的技术,并通过体内外实验验证了扩增的mRNA具有的抗肿瘤活性。

研究取得成果如下:1.证实了纯化的肿瘤组织细胞抗原的免疫效果高于肿瘤组织免疫原。应用组织酶消化与差速离心法从肝癌组织分离纯化肝癌细胞,通过超声获取肝癌细胞与肝癌组织蛋白。将上述两组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过ELISA测定小鼠血浆抗肿瘤抗原的免疫效价,Trizol提取小鼠脾脏的总RNA,应用凝胶电泳与紫外测定提取RNA的完整性与含量。

实验结果显示:（1）分离纯化的肝癌细胞蛋白抗原免疫的动物获得血清抗肿瘤效价与明显优于肝癌组织直接提取蛋白抗原,（2）肝癌细胞蛋白免疫动物的脾细胞抗肝癌的活性高于肝癌组织直接提取蛋白抗原组。（3）提取的RNA电泳显示了提取RNA具有完整性,提取的RNA含量在150μg/只脾左右,OD260/OD280在1.8-2.0之间。

2. 成功建立了免疫活性RNA（mRNA）体外整体扩增的技术免疫小鼠获取的脾细胞总RNA中的mRNA逆转录成cDNA,在逆转录过程中,（1）设计12种与mRNA POLY（A）结合的寡核苷酸序列,保证总RNA中所有的具有POLY（A）mRNA得以逆转录,并包含一段公用引物,用于下一步cDNA扩增（2）寡核苷酸Cap,包含T7RNA聚合酶的启动子序列与转换序列GGG。针对逆转录获得cDNA,应用通用引物及长片段扩增PCR反应试剂进行所有cDNA同步扩增,扩增后的DNA应用电泳进行观察,紫外检测DNA含量。以扩增的cDNA为模板,应用T7体外RNA转录反应体系进行整体RNA的转录,转录的RNA通过紫外检测含量。选择GAPDH、Actin、IFG-γ等基因,根据基因序列分别设计目的片段长度为179 bp、987 bp、1424 bp的引物,分别以等体积的抗肿瘤iRNA和经过整体扩增的AT-iRNA为模板,经过逆转录后分别进行实时荧光定量PCR检测,产物进行凝胶电泳。通过观察Ct值以及电泳条带的亮度、位置,判断整体扩增的mRNA的完整性。通过RNA含量计算mRNA扩增效果。

实验结果显示（1）4ng逆转录cDNA经过体外扩增,扩增产物纯化后的电泳显示不同长度片段扩增产物产生,含量测定为2.5μg,扩增效率为625倍。

（2）在体外转录的模板是cDNA100ng,最终最多扩增的数量是13μg,扩增100多倍。

（3）分别以等体积的抗肿瘤iRNA和经过整体扩增的AT-iRNA为模板,经过逆转录后通过实时荧光定量PCR法检测GAPDH等内参基因以及IFN-γ等的基因的表达。通过Ct值应用相对定量法计算这些基因经过整体扩增后的扩增倍数。结果表明与原始iRNA相比,扩增后的AT-iRNA中GAPDH、IFN-γ等基因得到有效扩增,倍率200倍~1200倍不等,不仅说明了体外扩增工艺的保真性,而且基因mRNA绝对含量显著增加。

参考文献

[1]Pronase independent flow cytometry crossmatching of rituximab treated patients[J].Mats Alheim,Lars Wennberg,Ann-Charlotte Wikstr?m.Human Immunology.2018(2)

[2]MicroRNA-140 suppresses osteosarcoma tumor growth by enhancing anti-tumor immune response and blocking mTOR signaling[J].Xianglu Ji,Enbo Wang,Feng Tian.Biochemical and Biophysical Research Communicatio.2018(1)

[3]Tolerance development in Listeria monocytogenes-Escherichia coli dual-species biofilms after sublethal exposures to pronase-benzalkonium chloride combined treatments[J].Pedro Rodríguez-López,Marta López Cabo.Food Microbiology.2017

[4]Mechanism of action of mRNA-based vaccines[J].Iavarone,O’hagan,Yu,Delahaye,Ulmer.Expert Review of Vaccines.2017(9)

[5]赵冠杰.抗肝癌免疫核糖核酸整体扩增技术的建立及抗肝癌作用研究[D].吉林大学,2019.