人芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人芳基硫酸酯酶A(ASA)的含量。

实验原理

人芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人芳基硫酸酯酶A(ASA)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人芳基硫酸酯酶A(ASA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA试剂盒

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于高脂饮食条件下硫脑苷脂在动脉粥样硬化过程中合成与代谢的研究

通过建立动脉粥样硬化的动物模型,在先前实验结论的基础上,通过检测多个脏器的硫脑苷脂合成酶和分解酶水平变化,找出血清中硫脑苷脂可能的主要来源,旨在明确血清中硫脑苷脂的合成和代谢情况,已达到可以调控血清中硫脑苷脂含量为目的,为动脉粥样硬化系列疾病的诊断和治疗提供一个新的思路和方法。

方法:选取10只健康雄性新西兰大耳白兔,给予高脂饮食的饲养模式建立兔动脉粥样硬化模型。首先,正常模式中给予普通兔饲料喂养7天后,随机分为两组,即高脂模型组5只和正常对照组5只。模型组每天给予等量的高脂饲料喂养,对照组每天给予等量的普通饲料喂养,每只兔子的饮食量控制在135g/天,自由饮水。其次,两组分别于饲料喂养前、4周末、8周末、12周末、16周末测量其体重、血脂水平及血清硫脑苷脂水平。每次采血前需禁食12h。最后,高脂饮食喂养16周后,处死动物,留取兔肝脏、肾脏及其小肠组织并制作病理切片观察硫脑苷脂在各组织中的积累情况。同时,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹分析技术来测定肝脏、肾脏及小肠中脑苷脂磺基转移酶（cerebroside sulfonyltransferase,CST）和芳基硫酸酯酶A（arylsulfatase A,ARSA）的表达,其水平变化反应硫脑苷脂的合成和分解情况。通过调节CST和ARSA的活性来控制硫脑苷脂代谢,从而影响硫脑苷脂在血液中的含量,为动脉硬化等心血管疾病提供一个的治疗思路。

结果:1.通过高脂饮食16周的饲养,成功建立了兔高脂血症和动脉粥样硬化模型;与对照组相比,模型组血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）水平均显著升高（P＜0.05）;

2. 主动脉苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色显示:与对照组相比,模型组可见主动脉内膜明显增厚、富含大量泡沫细胞、血管腔显著狭窄;

3. 冰冻切片油红O脂肪染色显示:与对照组相比,模型组肝脏和肾脏标本中聚集着过量的脂肪组织,小肠标本中无脂肪组织的聚集;

4. 免疫蛋白分析和实时荧光定量PCR显示:与对照组相比,模型组肝脏、肾脏组织中CST的表达显著高于正常组（P＜0.05）,而ARSA在两组中的表达无显著性差异;5.模型组血清硫脑苷脂水平显著高于对照组（P＜0.05）。

结论:在兔动脉粥样硬化模型中,高脂饮食饲养造模成功,我们发现血清硫脑苷脂较常规检测指标更能反映了动脉粥样硬化的发生发展过程,因此,它可能代替目前的检测因子成为未来动脉粥样硬化类疾病的新型检测指标;同时,通过比较两组肝脏、肾脏和小肠组织中CST和ARSA的表达情况,得知肝、肾组织中CST的过度表达是导致硫脑苷脂升高的主要原因,这促使我们从代谢角度考虑精确调控CST基因的分子机制是对未来心血管疾病治疗的重要切入点。

参考文献

[1]Basic pathogenic mechanisms of atherosclerosis[J].Hamad Abdulsalam Hamad Alfarisi,Zenab B.Hamad Mohamed,Muhammad Bin Ibrahim.Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences.2020(1)

[2]Fenofibrate increases the amount of sulfatide which seems beneficial against Covid-19[J].Karsten Buschard.Medical Hypotheses.2020(prep)

[3]Glycosphingolipids and Infection.Potential New Therapeutic Avenues.[J].Aerts Johannes M F G,Artola M,van Eijk M,Ferraz M J,Boot R G.Frontiers in cell and developmental biology.2019

[4]Circulating Sulfatide,A Novel Biomarker for ST-Segment Elevation Myocardial Infarction[J].Gang Li,Rui Hu,Yifang Guo,Lili He,Qingjuan Zuo,Yan Wang.Journal of Atherosclerosis and Thrombosis.2019(1)

[5]孙鑫.高脂饮食条件下硫脑苷脂在动脉粥样硬化过程中合成与代谢的研究[D].河北医科大学,2021.