两步法RT-PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

两步法RT-PCR试剂盒是整合cDNA链合成试剂（RT试剂盒）和即用型qPCR试剂而得的qRT-PCR试剂盒。cDNA链合成反应和qPCR反应分别在两个离心管中进行。

两步法RT-PCR试剂盒包含两步法RT-PCR的全部试剂，将RT反应和PCR反应结合在同一个试剂盒中，提供了优化的RT Mix和PCR Mix。独特的RT Mix，能简便高效的合成高质量的**链cDNA，2×PCR EasyTMMix Plus具有高效的特异性扩增，两者的有机结合使得目的基因的检测更加灵敏。

两步法RT-PCR试剂盒

本试剂盒具有下列特点：

1.即开即用，足够50次RT反应（10uL体系）和50次qPCR反应（20 uL体系）。

2.RT和PCR分开进行，方便优化RT和qPCR条件，也方便一个RT反应用于多个不同引物的qPCR扩增。

3.RT mix中含除酶、模板和引物以外的RT成分，简化了反应设置步骤。

4.qPCR mix是2×预配液，也简化了反应设置步骤。

5.qPCR mix含qPCR染料，无需另外加入相关荧光PCR染料。

6.扩增效率高,最长可扩增5 Kbp以上的RNA。

7.提供定量PCR专用模板稀释液，保证在制作标准曲线时低浓度样品的准确性。

使用方法

一、样品RNA的制备

1、提取方法提取样品的RNA，得到的RNA一定要溶解在RNase-free的超纯水中。

2、如果需要用RNA制备标准曲线，则需在此步用定量PCR专用模板稀释液将RNA样品稀释不同梯度，并分别作为下步RT反应的模板。

3、由于污染的gDNA会严重影响RNA的定量，因必须彻底去除RNA样品中的gDNA污染。

二：RT（逆转录）反应合成cDNA

4、配制RT反应体系（10 uL体系），在每个管中加入下列成分:成分加入量总RNA 100-500 ng；2×RT mix 4 uL MMLV逆转录酶；1 uL RNase-free水，补到10 uL。

5、42℃保温60分钟。此步为RT反应。

6、85℃保温5秒以终止反应，然后放置在冰上待用。

7、合成的cDNA可以直接作为下步qPCR模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。如果需要用cDNA制备标准曲线，则需在此步用定量PCR专用模板稀释液将cDNA样品稀释不同梯度，并分别作为下步qPCR反应的模板。

三、qPCR（20 uL体系）

8、在每个PCR管中加入下列成分：成分加入量qPCR MagicMix 10 uL cDNA样品；2 uL PCR正向引物(10 pmol/uL)；1 uL PCR反向引物(10 pmol/uL)；1 uL自备ROX染料I或II；2 uL RNase-free水4 uL。

应用^[4][5]

用于猪四种肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及猪流行性腹泻病毒的分离鉴定研究

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCo V）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus,Po RV）是当前导致猪群发生病毒性腹泻的四种主要病原,且常发生混合感染,对我国养猪业危害巨大。这四种腹泻病均以呕吐、厌食、腹泻、脱水为主要特征,只根据临床症状难以区分,需借助实验室方法加以鉴别诊断。

研究建立了PEDV、TGEV、PDCo V及Po RV的四重RT-PCR检测方法,并在此基础上进行PEDV的分离鉴定及毒株的序列分析,具体研究如下:

1.针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCo V的N蛋白基因以及Ro RV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物,进而构建相应的质粒标准品。经过对引物浓度、退火温度、循环数三个参数进行优化后,确定本研究中该四重RT-PCR检测方法的引物浓度为0.375 pmol/μL,退火温度为50.9℃,循环数为30个循环。随后进行敏感性、特异性、重复性试验以对该方法进行验证。敏感性试验结果显示,对PEDV-M、TGEV-N、PDCo V-N、Po RV-VP7最低检测下限分别为:1.75×10~2Copies/μL、1.5×10~3Copies/μL、1.6×10~2Copies/μL、1.6×10~2Copies/μL;特异性试验结果显示,仅可检测出本研究中的四种靶病毒,而对猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV、PRV不能检出;重复性试验结果显示,选取10~8、10~6、10~4Copies/μL三个不同浓度的重组质粒作为模板,其他条件不变,分别进行5次重复试验,5次试验均可扩增出清晰均匀的条带。将送检的52份临床样品通过所建立的四重RT-PCR方法进行检测,结果显示,PDEV、TGEV、PDCo V、Po RV的阳性率分别为37%（19份）、6%（3份）、10%（5份）、25%（13份）。其中PEDV和Po RV混合感染2份（4%）,PEDV和TGEV混合感染2份（4%）,PEDV和PDCo V混合感染1份（2%）,随机挑选5个检测为阳性的样本进行测序验证,结果均为相应病毒的基因片段。

2.将应用上述四重RT-PCR方法检测出的PEDV阳性组织样本挑选出来,用于进行PEDV的分离。将处理好的病料上清接种于Vero细胞,并利用RT-PCR和间接免疫荧光试验（IFA）进行验证,结果成功分离到一株PEDV,命名为QH-202105。将该分离株传代培养至第10代,提取RNA后进行全基因组的扩增并送至公司测序,结合在Gen Bank下载的参考序列,对分离株QH-202105的全基因组进行核苷酸同源性比对和系统发育树的构建。核苷酸同源性比对分析结果显示,本研究分离毒株与美国分离毒株USA/Colorado/2013核苷酸同源性最高,为99.1%;与CHM2013株同源性最低,为96.5%;与变异毒株AJ1102同源性较高,为98.2%;与经典毒株CV777的同源性较低,为96.6%。遗传发育树结果显示,本研究分离株属于G2基因群,与G1基因群中经典毒株CV777属不同分支,与G2基因群中变异株AJ1102亲缘关系很近。同时对QH-202105毒株S蛋白基因进行遗传发育树的构建,并进一步分析QH-202105毒株S蛋白氨基酸序列的变异程度及预测氨基酸突变对其毒株功能的影响。

参考文献

[1]Emerging strains of porcine epidemic diarrhoea virus（PEDv）in Mexico.[J].Reveles-Félix Saúl,Carreón-Nápoles Rosalba,Mendoza-Elvira Susana,Quintero-Ramírez Víctor,García-Sánchez Juvencio,Martínez-Bautista Rebeca,Saavedra-Monta?ez Manuel,Mosqueda Gualito Juan Joel,Sánchez-Betancourt JoséIvan.Transboundary and emerging diseases.2020(2)

[2]Pathogenicity and immunogenicity of a new strain of porcine epidemic diarrhea virus containing a novel deletion in the N gene[J].Xian-Wei Wang,Mi Wang,Jing Zhan,Qian-Yu Liu,Lin-lin Fang,Chen-yao Zhao,Ping Jiang,Yu-Feng Li,Juan Bai.Veterinary Microbiology.2020

[3]Development of a Taq Man-probe-based multiplex real-time PCR for the simultaneous detection of emerging and reemerging swine coronaviruses.[J].Pan Zhongzhou,Lu Jiaxuan,Wang Ningning,He Wan-Ting,Zhang Letian,Zhao Wen,Su Shuo.Virulence.2020(1)

[4]Porcine epidemic diarrhea virus:Molecular mechanisms of attenuation and vaccines[J].Zhiwei Li,Zhiqian Ma,Yang Li,Sheng Gao,Shuqi Xiao.Microbial Pathogenesis.2020(prep)

[5]辛忠昊.猪四种肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及猪流行性腹泻病毒的分离鉴定[D].山东农业大学,2022.