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Recombinant Streptolysin O的应用及分离纯化

发布日期:2019/12/10 9:25:28

背景[1]

GAS产生的链球菌溶血素O(streptolysin O,Slo)能够使细胞膜产生大的孔道,毒蛋白进入细胞质,对细胞产生毒性作用,因此, Recombinant Streptolysin O被认为是一种重要的外毒素。此外, Recombinant Streptolysin O具有极强的抗原性,感染化脓性链球菌后2~3周内,85%以上病人会产生Slo抗体,病愈后可持续数月甚至数年;并且在风湿热、强直性脊柱炎等疾病患者血清中也存在较高滴度Recombinant Streptolysin O抗体,血清中抗链球菌溶血素O(anti-streptolysin O,ASO)的测定可广泛应用于与链球菌感染有关的疾病如肾小球肾炎、猩红热、扁桃体炎、风湿热及链球菌感染后反应性关节炎等的診断中,制备有效的检测患者血清中Slo抗体的Slo抗原,对于鉴别诊断链球菌感染相关疾病以及疗效评价具有重要价值。

应用[1]

Recombinant Streptolysin O有广泛的应用前景,不仅可应用于与链球菌感染有关疾病以及链球菌感染后反应性关节炎等疾病血清中ASO的检验;还能利用它提高细胞膜通透性,将链球菌溶血素O溶液加入受体细胞中,给予一定的作用时间,即可达到通透效果。通过这种方法可使目的细胞抽提物的大分子蛋白质和核苷酸克服细胞膜的生物屏障,进入需要修复的受体细胞后可以发挥重编程作用,使受体细胞转变为目的细胞,这一策略为人造器官提供了新的种子细胞来源,为病损组织器官替代修复治疗提供了新思路。此外Recombinant Streptolysin 蛋白还可用于链球菌感染引起的肺炎的辅助治疗。目前,获得Slo可从天然培养中分离以及重组表达获得。天然培养分离是通过大规模培养化脓性链球菌获得其代谢产物再分离获得Recombinant Streptolysin O,该方法最大的优点是得到的Slo为天然结构,但操作复杂且产量低。本研究结果为利用大肠杆菌表达系统大量获得既具有溶血活性,又具有特异性免疫活性的小分子Slo抗原奠定了基础。

Recombinant Streptolysin O的诱导表达[2]

将构建的基因工程菌接种到含氨苄青霉素的LB培养基中,37℃震荡培养过夜后,转接到新鲜LB培养基,37℃震荡培养到OD600值0.5左右时加入终浓度为1mmol/L的IPTG,诱导4h后离心,收集菌体,进行SDS-PAGE电泳鉴定。

Recombinant Streptolysin O的分离纯化[2]

采用参考文献的方法,离心收集菌体,菌体洗涤3次,加大肠杆菌超声破碎液重悬菌体,超声处理破碎菌体,离心收集包涵体沉淀,2M的尿素洗涤沉淀,用变性液溶解包涵体沉淀。利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化,操作步骤按照康为公司的Ni-NTA琼脂糖凝胶操说明书进行,纯化蛋白经12%SDS-PAGE电泳鉴定。取纯化蛋白变性溶液逐滴滴加到复性液中,滴加过程中不断搅拌,稀释20倍后置于4℃冰箱24h进行复性,再利用Millipore超滤管浓缩蛋白溶液后备用。

参考文献

[1] 化脓性链球菌溶血素O活性结构重组蛋白的制备 杨思源 潘敬梅 

[2] Sun Hua,Zhang Zi-de.Expression and purification and of human hydrogen peroxidase in E.coli and identification of its biological activity.Journal of Jinan University,2014,35(2):187-191.