N6培养基的应用

背景^[1-3]

N6培养基又称Chu's N-6 Medium，由11种无机盐和5种有机物构成，其特点是成分相对比较简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高。适用于单子叶植物花药培养，柑橘花药培养也适合,在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。

CHU-N6培养基用于培养植物细胞、组织、器官。硝酸钾是氮源。甘氨酸作为氨基酸来源。

N6培养基

N6培养基配方(mg/L)

硝酸钾：2800；硫酸铵：463;磷酸二氢钾：400;硫酸镁(MgSO4·7H2O)：185;氯化钙(CaCl2·2H2O)：165;乙二胺四乙酸二钠：37.3;硫酸亚铁(FeSO4·7H2O):27.8;

硫酸锰(MnSO4·H2O)：4.4;硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：1.5;硼酸：1.6;碘化钾：0.8;维生素B1(盐酸硫胺素)：1.0;维生素B6(盐酸吡哆醇)：0.5;烟酸：0.5;甘氨酸：2.0;蔗糖：20000。

配制方法：

1.用600ml蒸馏水溶解3.97g脱水培养基，用少量蒸馏水冲洗残余培养基粉末。

轻轻搅动使培养基完全溶解。

2.加入所有热稳定添加剂。

3.用1N HCl/NaOH调节pH。定容至1000ml。

4.121ºC灭菌15 min。冷却至45ºC后，加入过滤除菌的热敏型添加剂分装到无菌容器中。

培养周期：5周;

相对湿度：60%±2%;

温度：22°C±2°C;

光照周期(D:N):16h:8h。

应用^[4][5]

用于水稻钙结合小分子蛋白基因smCaBP的分离与鉴定研究

C DPK、CaM/CML、CBL-CIPK等钙信号蛋白家族在植物钙信号转导过程中起重要作用,其少数成员的生化特征和基因功能研究的比较透彻。但是,只含有1个EF-hand的钙结合小分子蛋白基因（small molecule calcium binding protein gene,smCaB P）在植物逆境适应性中功能的研究还很少。目前,在水稻中只发现了一个受ABA和渗透胁迫诱导表达的钙结合小分子蛋白基因EFA27。

从水稻低温表达芯片和胁迫诱导表达中筛选出2个新的水稻钙结合小分子蛋白基因,我将它们命名为smCaBP2和smCaBP3。比较了这3个钙结合小分子蛋白的分子结构和钙结合特性,研究了它们在非生物逆境中的诱导表达和功能。

具体结果如下：1.蛋白结构分析表明,植物smCaBP均含有1个EF-hand motif,可分为二大类,smCaBP2（12.3kDa）和smCaBP3（13.9kDa）,为大类。smCaBP1（27.1kDa）与它们的同源性分别为58%和40%,属于第二大类。在EF-hand loop中,smCaBP2与smCaBP3比smCaBP1多1个谷氨酰胺（E）或天冬氨酸（D）。

2.体外钙结合测定表明,GST-smCaBPs分别与CaCl2,MgCl2以及CaCl2+MgCl2反应后,在Native-PAGE中除GST-smCaBPl外,对GST-smCaBP2和GST-smCaBP3与钙离子选择性结合后迁移率变小,镁离子对其影响不大。推测GST-smCaBP2和GST-smCaBP3在体外与钙离子结合后,构象改变。

3.RT-PCR检测表明,smCaBP1在200 mmol/L NaCl和20%PEG-6000处理下诱导表达。smCaBP2受40℃、200 mmol/L NaCl和20%PEG-6000处理下诱导表达。smCaBP3在20%PEG-6000处理诱导表达。有趣的是,smCaBP1,2,3均受100μmmol/L ABA处理的强烈诱导表达。推测它们可能参与ABA的信号传导过程。

4.潮霉素和PCR检测表明,tmCaBP1,2,3的T-DNA插入突变体均为杂合子,与野生型相比,内源基因表达水平不同程度地下降,其株高略矮,其生长发育正常。smCaBPl,2,3超表达转基因阳性植株的内源基因表达增强,生长发育正常。

5.ABA敏感性检测表明,与野生型相比,ABA处理对smCaBP1和smCaBP2超表达转基因植株幼芽的抑制更严重,根系的敏感性明显大于地上部。

6.耐盐性和耐旱性鉴定表明,水培14d水稻幼苗在20%PEG-6000处理7d恢复7d后,smCaBP1和smCaBP2超表达转基因植株的存活率分别比对照中花11高36.65%和25.15%。水培14d水稻幼苗在200mmol/LNaCl处理4d恢复7d后,smCaBP1和smCaBP2超表达转基因植株的存活率分别比对照中花11高36.2%和2.93%。因此,smCaBP1可以提高水稻的耐盐性和耐旱性,smCaBP2仅仅提高水稻的耐旱性,对耐盐性影响不大。

参考文献

[1]An S-locus receptor-like kinase plays a role as a negative regulator in plant defense responses[J].Ho Soo Kim,Mi Soon Jung,Sang Min Lee,Kyung Eun Kim,Hyejin Byun,Man Soo Choi,Hyeong Cheol Park,Moo Je Cho,Woo Sik Chung.Biochemical and Biophysical Research Communications.2009(3)

[2]Calcineurin B-like proteins in rice can bind with calcium ion and associate with the Arabidopsis CIPK family members[J].Sunhee Yoon,Jimyeong Park,Migyeong Ryu,In Sun Yoon,Kyung-Nam Kim.Plant Science.2009(6)

[3]The Arabidopsis Calcium Sensor Calcineurin B-Like 3 Inhibits the 5’-Methylthioadenosine Nucleosidase in a Calcium-Dependent Manner1[C][W][OA][J].Oh,Seung-Ick,Park,Jimyeong,Yoon,Sunhee,Kim,Yungyeong,Park,Soojin,Ryu,Migyeong,Nam,Min Jung,Ok,Sung Han,Kim,Jeong-Kook,Shin,Jeong-Sheop,Kim,Kyung-Nam.Plant Physiology.2008(4)

[4]Arabidopsis TONNEAU1 Proteins Are Essential for Preprophase Band Formation and Interact with Centrin（W）[J].Azimzadeh,Juliette,Nacry,Philippe,Christodoulidou,Anna,Drevensek,Stéphanie,Camilleri,Christine,Amiour,Nardjis,Parcy,Fran?ois,Pastuglia,Martine,Bouchez,David.Plant Cell.2008(8)

[5]孔霖.水稻钙结合小分子蛋白基因smCaBP的分离与鉴定[D].华中农业大学,2013.