HCCLM3人高转移肝癌细胞的应用

背景^[1-3]

HCCLM3人高转移肝癌细胞是一株由人肝癌细胞株MHCC97-H接种裸鼠，进行3次肺转移筛选、取肺转移瘤建成皮下接种后高度自发性Chemicalbook肺转移的肝癌细胞系。HCCLM3细胞被广泛用于人肝癌发病机理的基础和临床研究，也可用于抗肿瘤药物筛选。

HCCLM3人高转移肝癌细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于LncRNA DLEU1对肝癌的抑制作用及汉黄芩素干预的机制研究

通过RNA荧光原位杂交（RNA fluorescenceinsituhybridization,RNAFISH）技术检测了肝癌患者的肝癌组织和癌旁组织芯片中DLEU1的表达差异,分析了DLEU1的表达与肝癌患者的临床病理资料及生存期的相关性;其次,通过构建过表达和干扰表达DLEU1的肝癌细胞模型,采用CCK-8检测实验、EdU细胞增殖检测实验、细胞克隆形成实验、细胞周期检测实验、细胞凋亡检测实验以及Transwell实验研究了DLEU1过表达和干扰表达对肝癌细胞的细胞活力、细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期进程、细胞凋亡以及迁移的影响;最后,利用DLEU1稳定过表达和干扰表达的肝癌细胞HCCLM3建立裸鼠皮下移植瘤模型,研究DLEU1对小鼠体内移植瘤生长的影响;同时,应用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测肿瘤组织切片中细胞的凋亡情况。

结果:RNA FISH实验结果显示,DLEU1在肝癌组织中表达低于对应的癌旁组织;肝癌组织中DLEU1表达水平对患者AFP表达、肿瘤大小、肿瘤数目、癌栓有无、包膜是否完整、分化等均有影响;DLEU1低表达的肝癌患者与较低的无病生存期相关。CCK-8检测实验、EdU细胞增殖检测实验、细胞克隆形成实验、细胞周期检测实验以及细胞凋亡检测实验结果显示,DLEU1过表达可以降低肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的细胞活力、抑制细胞增殖和细胞克隆形成、诱导细胞周期G1/S期的阻滞以及促进细胞凋亡,而DLEU1干扰表达则可以提高SMMC7721细胞和HCCLM3细胞的细胞活力、促进细胞增殖和细胞克隆形成、促进细胞周期G1/S期的进程以及抑制细胞凋亡;Transwell细胞迁移实验结果显示,DLEU1过表达和干扰表达对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的体外迁移没有显著影响;小鼠移植瘤实验结果显示,接种过表达DLEU1的HCCLM3细胞组荷瘤小鼠的瘤体体积和重量均较对照组显著降低,而接种干扰表达DLEU1的HCCLM3组荷瘤小鼠的瘤体体积及重量较对照组显著增加;同时,TUNEL实验检测结果显示,过表达DLEU1组瘤体细胞凋亡高于对照组,而干扰表达DLEU1组瘤体细胞凋亡少于对照组。结论:DLEU1在肝癌组织中低表达,且与患者无病生存期相关。

体外细胞水平的研究结果表明,DLEU1过表达可诱导肝癌细胞的细胞周期G1/S期阻滞,抑制肝癌细胞的增殖,促进肝癌细胞的凋亡;而DLEU1干扰表达则可以促进肝癌细胞的细胞周期G1/S期进程和细胞增殖,抑制肝癌细胞的凋亡;体内实验进一步证实了DLEU1过表达可以抑制小鼠体内移植瘤的生长,促进肝癌细胞的凋亡;而DLEU1干扰表达则可以促进小鼠体内移植瘤的生长,抑制肝癌细胞的凋亡。

LncRNA DLEU1调控肝癌细胞增殖和凋亡的机制研究目的:阐明DLEU1调控肝癌细胞增殖和凋亡的分子机制;明确DLEU1可能通过调控Hippo通路以及RNA m6A修饰影响CYR61（Cysteine-rich angiogenic inducer 61）的表达而调控肝癌细胞增殖和凋亡。

方法:首先采用RNA sequencing（RNA-seq）检测了DLEU1过表达的肝癌细胞SMMC7721中转录组的改变,并进行差异基因表达分析和KEGG通路富集分析。其次,通过RT-qPCR（Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction）实验检测DLEU1过表达和干扰表达对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中Hippo通路关键效应分子YAP/TAZ及其靶基因CTGF（Connective tissue growth factor）和CYR61表达的影响;采用Western blot实验检测了DLEU1对肝癌细胞中Hippo信号通路的终末效应组分YAP/TAZ以及两个核心成分MOB1（Mps One Binder Kinase Activator-Like 1）和LATS1（Large Tumor Suppressor Kinase 1）的表达及其磷酸化水平的影响。

在明确干扰表达DLEU1的肝癌细胞中CYR61蛋白水平较转录组水平显著增高后,通过在干扰表达DLEU1的肝癌细胞中干扰表达CYR61,采用EdU细胞增殖检测实验、细胞周期检测实验以及细胞凋亡检测实验检测CYR61干扰表达对干扰表达DLEU1的肝癌细胞的增殖、细胞周期进程以及细胞凋亡的影响。

参考文献

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