小鼠肝上皮细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠肝上皮细胞是于1952年建系，源于正常C3H/An小鼠的肝脏组织；NCTC 1469细胞可表达H-2K抗原，鼠痘病毒阴性。

细胞接收后的处理方法

1）收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染。

2）在显微镜下确认细胞生长状态时，在低倍镜（4或5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20×物镜下，同时给细胞拍照各2-3张（10×，20×都要拍照），作为售后的依据。

3）观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

小鼠肝上皮细胞

细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；马血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于小鼠肝细胞特异性敲除MANF通过促进上皮间质转化发挥加快肝细胞癌进展的作用研究

是在肝细胞特异性MANF敲除鼠上再次验证MANF对HCC的作用。

方法:在野生型（wild type,WT）小鼠和肝细胞特异性敲除MANF（hepatocyte-specific MANF deficiency,KO）小鼠出生后第15天腹腔注射DEN（N-nitrosodiethylamine,二乙基亚硝胺）（30 mg/kg）构建小鼠HCC模型,造模后继续饲养8个月,WT鼠取肝脏采用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）法检测MANF在肝癌组织和癌旁组织的表达;采用HE染色法比较WT小鼠和KO小鼠造模8个月后肿瘤形成的情况;采用IHC、免疫蛋白印迹法（western blot,WB）和实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System,QPCR）法分别检测并比较上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的相关指标E-cadherin、β-catenin和Vimentin在两组小鼠肝脏内m RNA和蛋白水平的表达,随后取DEN诱导肝癌20个月WT小鼠和KO小鼠的肺组织使用IHC的方法检测HCC肺部转移情况;为验证MANF和p65之间的作用,在人肝癌组织中通过免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation,Co-IP）实验确定MANF和p65的相互作用,人源肝癌细胞株Hep G2细胞中使用核浆分离的胞浆蛋白和胞核蛋白分别进行Co-IP实验确定MANF和p65相互作用的细胞内定位。采用IHC、Western Blot方法或QPCR方法检测NF-κB下游关键分子在肝癌小鼠模型中表达的水平。

结果:1.在DEN诱导野生型小鼠肝细胞癌模型中检测MANF表达免疫组织化学结果提示MANF在小鼠的肝癌组织中的表达比在癌旁组织中的表达低。

2. 肝细胞来源MANF对HCC的影响肝脏大体照片和HE染色结果发现肝细胞特异性敲除MANF促进肝脏表面肿瘤结节的生长,且肝组织中的细胞异型性更明显。

3. 肝细胞特异性敲除MANF对小鼠肝脏EMT各指标水平及肺转移的影响WB,IHC和QPCR的结果显示:和WT小鼠相比,KO小鼠肝脏内E-cadherin的表达下调,而Vimentin和β-catenin的表达上调。

结果提示,肝细胞特异性敲除MANF促进小鼠肝脏EMT。在DEN造模20月小鼠的肺组织做HE染色,发现肝细胞特异性敲除MANF小鼠的肺肿瘤更明显,并采用肝上皮细胞标志物Hep Par1做免疫组化,发现肺肿瘤来源于肝脏,说明肝细胞特异性敲除MANF促进肝癌的肺部转移。

参考文献

[1]Mesencephalic Astrocyte-Derived Neurotrophic Factor Inhibits Liver Cancer Through Small Ubiquitin-Related Modifier（SUMO）ylation-Related Suppression of NF-κB/Snail Signaling Pathway and Epithelial-Mesenchymal Transition.[J].Liu Jun,Wu Zhengsheng,Han Dan,Wei Chuansheng,Liang Yanyan,Jiang Tongcui,Chen Lu,Sha Manqi,Cao Yajie,Huang Fan,Geng Xiaoping,Yu Jishuang,Shen Yujun,Wang Hua,Feng Lijie,Wang Dong,Fang Shengyun,Wang Siying,Shen Yuxian.Hepatology（Baltimore,Md.）.2020(4)

[2]Transcriptomic changes during TGF-β-mediated differentiation of airway fibroblasts to myofibroblasts.[J].Walker Erin Joanne,Heydet Deborah,Veldre Timothy,Ghildyal Reena.Scientific reports.2019(1)

[3]Hepatitis B X protein upregulates decoy receptor 3 expression via the PI3K/NF-κB pathway[J].Dong-Yu Liang,Shuang Sha,Qingqing Yi,Junfeng Shi,Yingmin Chen,Yanqiang Hou,Qing Chang.Cellular Signalling.2019

[4]Sumoylation of Flotillin-1 promotes EMT in metastatic prostate cancer by suppressing Snail degradation.[J].Jang Donghwan,Kwon Hayeong,Choi Moonjeong,Lee Jaewoong,Pak Yunbae.Oncogene.2019(17)

[5]韩丹.小鼠肝细胞特异性敲除MANF通过促进上皮间质转化发挥加快肝细胞癌进展的作用[D].安徽医科大学,2021.