人凋亡诱导因子(AIF)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人凋亡诱导因子(AIF)ELISA KIT运用双抗夹心法ELISA法定量测定血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中AIF含量。

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA或肝素，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3. 细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

人凋亡诱导因子(AIF)ELISA KIT

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品稀释液100μL，余孔分别加样品稀释液50ul和样品50μL，注意不要有气泡，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育30分钟。

2.洗板3次，弃去液体，甩干或吸干。每个孔中加入配制好的酶标抗体工作液100μL（在使用前30分钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育30分钟。

3.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.提前将TMB A组分和B组分37℃温育15分钟

5.按用量1：1混合TMB A组分和B形成TMB工作液（用干净的枪头分别吸取B组分和A组分），每孔加(TMB工作液)90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育7-10分钟（根据实际显色，情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。

7.每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

9.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

应用^[4][5]

用于水蜡树果实提取物对结肠癌HCT-15细胞的增殖、千移及凋亡诱导因子AIF表达的影响研究

通过体外实验研究水蜡树果实提取物（Fruit of Ligustrum Obtusifolium Extract,FLOE）对结肠癌HCT-15细胞的增殖、迁移及凋亡诱导因子（Apoptosisi Iducing Fctor,AIF）表达的影响,探讨其可能的作用机制,为中药在结肠癌治疗中的研发及AIF应用于结肠癌治疗提供更多的理论依据。

方法:体外培养结肠癌细胞株HCT-15,取对数期细胞用于实验。将FLOE用不完全培养基RPMI-1640稀释成不同浓度:0μg/ml（对照组）、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml组,并用RPMI-1640不完全培养基稀释75%酒精（20μg/ml）,设置阴性对照。

采用普通光学显微镜观察在不同浓度药物分别处理24h、48h、72h、96h后细胞形态学变化,并在显微镜下计算贴壁细胞数量。采用MTS法检测不同浓度药物分别处理24h、48h、72h、96h后,对HCT-15细胞存活率的影响。采用集落实验检测不同浓度FLOE对结肠癌HCT-15细胞生存能力的影响;划痕实验检测在不同浓度药物处理后,对HCT-15细胞迁移能力的影响。采用Western bolt法检测在不同浓度药物作用48h后,对HC15细胞凋亡相关蛋白及AIF表达的影响。

结果:随着FLOE药物浓度的增高及作用时间的延长,HCT-15细胞伸展变差、细胞间隙增大、空泡化、细胞漂浮,细胞计数发现贴壁细胞也随之减少。MTS结果表明与对照组相比FLOE处理后的细胞存活率降低（P<0.05）,且呈时间及浓度依赖性。划痕实验结果表明与对照组相比FLOE处理后的细胞划痕区域相对宽度较宽（P<0.05）。集落实验结果表明FLOE处理后细胞集落形成数量明显降低,与对照组相比集落抑制率有统计学意义（P<0.05）。

Western bolt实验结果表明随着FLOE浓度的增高,Survivin、Mcl-1蛋白表达水平明显降低,而凋亡诱导因子AIF表达增加。结论:水蜡树果实提取物能抑制HCT-15细胞增殖及迁移,且呈浓度及时间依赖性。其机制可能通过下调抗凋亡蛋白的表达及上调凋亡诱导因子AIF的表达实现。

参考文献

[1]Lebein,a snake venom disintegrin,suppresses human colon cancer cells proliferation and tumor‐induced angiogenesis through cell cycle arrest,apoptosis induction and inhibition of VEGF expression[J].Ons Zakraoui,Cezary Marcinkiewicz,Zohra Aloui,Houcemeddine Othman,Renaud Grépin,Meriam Haoues,Makram Essafi,Najet Srairi‐Abid,Ammar Gasmi,Habib Karoui,Gilles Pagès,Khadija Essafi‐Benkhadir.Molecular Carcinogenesis.2017(1)

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[4]Crude extract of Rheum palmatum L induced cell death in LS1034 human colon cancer cells acts through the caspase‐dependent and‐independent pathways[J].Yi‐Shih Ma,Shu‐Chun Hsu,Shu‐Wen Weng,Chien‐Chih Yu,Jai‐Sing Yang,Kuang‐Chi Lai,Jing‐Pin Lin,Jaung‐Geng Lin,Jing‐Gung Chung.Environ.Toxicol.2014(9)

[5]鲁梦甜.水蜡树果实提取物对结肠癌HCT-15细胞的增殖、千移及凋亡诱导因子AIF表达的影响[D].中国医科大学,2019.