人艾杜糖硫酸酯酶(IDS)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人艾杜糖硫酸酯酶(IDS)ELISA KIT是利用双抗体夹心ELISA法定量测定人血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中艾杜糖硫酸酯酶(IDS)的含量。

实验原理：预先包被的抗体和检测相抗体都是亲和纯化多克隆抗体。检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的IDS呈正相关。

人艾杜糖硫酸酯酶(IDS)ELISA KIT

样本处理

血清：

室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，如保存过程中如有沉淀，请再次离心。

血浆：

应根据标本的要求选择EDTA，柠檬酸钠或者肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，在离心20分钟（2000-3000转/分），仔细收集上清，如保存过程中有沉淀，请再次离心。

尿液：

用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，如保存过程中有沉淀，请再次离心。

细胞培养上清：

检测分泌性的成份时，用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，当细胞浓度达到100万/ml左右，通过反复冻融，使细胞破坏并释放细胞内的成份，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，如保存过程中有沉淀，请再次离心。

操作步骤:

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于海洋细菌来源的新型糖胺聚糖降解酶的筛选、鉴定与应用研究

以硫酸软骨素为唯一碳源,在海泥中筛选出一株高效降解糖胺聚糖的菌株并进行了基因测序。通过生物信息学分析发现了一系列新型糖胺聚糖工具酶基因,并对这些基因进行了深入研究。

主要研究成果包括以下几个方面:（a）糖胺聚糖降解菌的筛选:以鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素CS-C为唯一碳源,从海泥中筛选得到15株多糖降解菌,其中编号为FC509的菌株表现为对褐藻胶、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、肝素等多种多糖的降解和利用活性。

重点对FC509菌株进行研究,通过对其进行全基因组测序和生物信息学分析,发现了一系列与糖胺聚糖降解利用相关的酶基因,并着重对其中的多个降解酶基因进行了深入研究。

（b）内切型糖胺聚糖裂解酶HCLase的相关研究:将HCLase基因构建到大肠杆菌表达载体中异源表达,并利用镍柱进行纯化。底物降解实验表明:该酶具有高效降解HA和CS的活性,因此被命名为HCLase。基本酶学性质研究表明:HCLase与已报道的糖胺聚糖降解酶不同,其具有嗜盐特性,这与它来源于海洋细菌有关,切表现出良好的温度和pH稳定性。底物降解模式分析表明:HCLase是一个内切型糖胺聚糖裂解酶,最小底物是4糖,最小产物是2糖。同时对HCLase不能降解的四糖进行了序列测定,其结构为△4,5HexUAα1-3GalNAc（6S）β1-4GlcUA（2S）β1-3GalNAc（6S）,这个结果揭示CS糖链中葡萄糖醛酸二位羟基的硫酸化会抑制HCLase对糖苷键的有效切割。HCLase的的优点是具有超高的酶活和良好的稳定性,这些特性使其成为具有巨大应用潜力的新型糖胺聚糖工具酶。

（c）外切型糖胺聚糖裂解酶HCDLase的相关研究:将HCDLase基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a中异源表达,并运用亲和层析柱对异源表达的酶进行了纯化。酶学性质研究和底物降解模式分析表明:该酶具有典型的外切型酶活性,可以从糖链的还原端有效降解HA、CS和DS,但不能降解Hep和HS,因此被命名为HCDLase。进一步的研究表明:HCDLase可以降解还原端荧光标记的硫酸化CS寡糖并产生二糖,但是不能降解荧光标记的DS和HA寡糖,这说明糖苷键类型和硫酸化程度影响HCDLase的降解活性。最后运用这种酶成功的对系列硫酸软骨素六糖和八糖进行了测序。上述一系列研究结果表明:HCDLase作为一个新型的外切型糖胺聚糖裂解酶,在糖胺聚糖的构效关系研究,特别是复杂CS功能寡糖测序中具有重要的应用价值。

（d）新型内切型糖胺聚糖硫酸酯酶4-O-Endosulfatase的相关研究:将该硫酸酯酶基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a中,并进行诱导表达和分离纯化。基本酶学性质研究表明:该酶在最适反应条件（30℃,pH8.0）下具表现出强的CS和DS硫酸酯酶活性;底物降解模式分析表明:该酶与已报道的CS/DS硫酸酯酶不同,不仅可以高效去除糖链端基的GalNAc上4位硫酸基团,而且还可以有效去除多糖链内部的4位硫酸根。多底物降解分析显示:该酶可有效去除多种CS和DS多糖链中的4位硫酸根,去除率在17-65%之间,硫酸基团的去除率与糖链的硫酸化模式密切相关。

参考文献

[1]Arylsulfatase K,a Novel Lysosomal Sulfatase[J].Elena Marie Wiegmann,Eva Westendorf,Ina Kalus,Thomas H.Pringle,Torben Lübke,Thomas Dierks.Journal of Biological Chemistry.2013(42)

[2]Hyaluronan:Towards novel anti-cancer therapeutics[J].Micha?S.Karbownik,Jerzy Z.Nowak.Pharmacological Reports.2013(5)

[3]Chondroitinase from baculovirus Bombyx mori nucleopolyhedrovirus and chondroitin sulfate from silkworm Bombyx mori[J].Nobuo Sugiura,Motoko Ikeda,Tatsumasa Shioiri,Mayumi Yoshimura,Michihiro Kobayashi,Hideto Watanabe.Glycobiology.2013(12)

[4]Glycosaminoglycans are functional ligands for receptor for advanced glycation end‐products in tumors[J].Shuji Mizumoto,Kazuyuki Sugahara.FEBS J.2013(10)

[5]王文爽.海洋细菌来源的新型糖胺聚糖降解酶的筛选、鉴定与应用[D].山东大学,2017.