兔肺癌标志物DR-70(DR-70TM)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

兔肺癌标志物DR-70(DR-70TM)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。该法适于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中肺癌标志物DR-70(DR-70TM)的含量。

实验原理：预先包被的抗体和检测相抗体都是亲和纯化多克隆抗体。检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的肺癌标志物DR-70(DR-70TM)呈正相关。

兔肺癌标志物DR-70(DR-70TM)ELISA试剂盒

操作步骤:

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养联合化疗对肺腺癌的体外杀伤作用研究

从非小细胞肺癌患者的恶性胸腔积液中获取成熟树突状细胞，探讨恶性胸腔积液来源的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养后对细胞因子诱导的杀伤细胞的作用及树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞两者共培养后联合奥沙利铂对GLC-82肺腺癌细胞的体外杀伤作用，为晚期肺癌患者提供治疗的新途径。

方法：①收集2012年9月至2013年10月我院20例经手术、纤维支气管镜、淋巴结活检、经皮肺穿刺活检、痰检等方法确诊为非小细胞肺癌且合并胸腔积液患者的胸腔积液，每例收集800-1000ml。双层密度梯度离心法及细胞贴壁法获取恶性胸腔积液中DC前体细胞，加入粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）培养9天收获成熟DC；

②分离健康人外周血单个核细胞（PBMC），加入干扰素-γ（IFN-γ）、CD3单克隆抗体（CD3Ab）、白介素-2（IL-2）体外诱导培养获取CIK细胞，将培养9天的部分CIK细胞与恶性胸腔积液来源的成熟DC以5:1比例混合继续培养5天获得树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK细胞）；

③流式细胞仪分别鉴定DC、CIK细胞及DC-CIK细胞的细胞表型；

④MTT法检测奥沙利铂、DC-CIK细胞、CIK细胞单组或联合作用与GLC-82肺腺癌细胞后对GLC-82肺腺癌细胞的杀伤作用。

结果：1.肺癌患者的恶性胸腔积液中可获取DC前体细胞，体外经GM-CSF、IL-4等细胞因子诱导培养9天后可获得成熟DC，经流式细胞仪检测培养9天的DC表面标志物与培养0天的DC表面标志物相比明显升高，分别为HLA-DR（70.97±8.96）%vs（41.36±8.57）%、CD80（56.61±7.01）%vs（14.38±5.16）%、CD83（58.85±7.05）%vs（18.49±9.43）%、CD86（60.27±13.94）%vs（20.39±6.67）%（P＜0.05）。

2. 人外周血来源的CIK细胞与恶性胸腔积液来源的DC联合培养获得DC-CIK细胞，流式细胞仪检测DC-CIK细胞的主要效应细胞CD3+/CD56+细胞（22.71±3.00）%与同期单独培养的CIK细胞的主要效应细胞CD3+/CD56+细胞（6.90±1.33）%相比明显增加（P＜0.05），MTT法检测DC-CIK细胞对GLC-82肺腺癌体外杀伤作用与CIK细胞亦明显增强（P＜0.05）。

3. DC-CIK细胞联合奥沙利铂对GLC-82肺腺癌细胞的杀伤作用明显高于单独DC-CIK细胞治疗组及单独奥沙利铂治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论:肺癌患者恶性胸腔积液中可获取DC的前体细胞，其在体外诱导培养可获得成熟DC，与人外周血来源的CIK细胞共培养后可促进CIK细胞的增殖、增强CIK细胞的杀伤毒性作用。

参考文献

[1]Enhanced antitumor effects of DC-activated CIKs to chemotherapy treatment in a single cohort of advanced non-small-cell lung cancer patients[J].Lili Yang,Baozhu Ren,Hui Li,Jinpu Yu,Shui Cao,Xishan Hao,Xiubao Ren.Cancer Immunology,Immunotherapy.2013(1)

[2]The dendritic cell–tumor cross-talk in cancer[J].Yuting Ma,Laetitia Aymeric,Clara Locher,Guido Kroemer,Laurence Zitvogel.Current Opinion in Immunology.2010(1)

[3]Cancer chemotherapy:not only a direct cytotoxic effect,but also an adjuvant for antitumor immunity[J].Cancer Immunology,Immunotherapy.2008(11)

[4]DC immunotherapy is highly effective for the inhibition of tumor metastasis or recurrence,although it is not efficient for the eradication of established solid tumors[J].Dae-Seog Lim,Jeong-Hwan Kim,Dong-Seong Lee,Cheol-Hee Yoon,Yong-Soo Bae.Cancer Immunology,Immunotherapy.2007(11)

[5]李晶.树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养联合化疗对肺腺癌的体外杀伤作用[D].承德医学院,2014.