隐藏在空调里的“杀手”——军团菌

随着社会经济的高速发展，中央空调、冷却水塔、热水沐浴器等不断涌入我们的生活，在给生活带来便利的同时，却由于设计不当、运行管理不善等原因成为军团菌的散播工具。军团菌是引起军团菌病的病原菌。军团菌病作为一种“城市文明病”，已成为现代化城市发展中面临的一个重要公共卫生问题。目前数十个国家均有散发病例及暴发流行报告，但由于军团菌分布较广，不易检测，不易消除及未被认识并重视其危害性等因素，军团菌一直肆无忌惮的威胁着我们的生命与健康。今天，让我们一起踏上与军团菌之战的征程。

分布广泛，生命力超强

军团菌为需氧革兰阴性杆菌，长2~4μm，宽0.3~0.4μm，无菌膜，不产酸，不产气，有一至数根端鞭毛或侧鞭毛，可运动[1]。其细胞壁具有独特的脂肪酸谱和泛醌结构，不易着色，因此常用Giemsa染色(呈红色)或Dieterle镀银染色(呈黑褐色)。该菌营养要求较高，生长时需要L一半胱氨酸、甲硫氨酸和铁离子等，在活性炭一酵母浸出液琼脂 (BCYE)培养基上培养3-4天可形成S型菌落。

军团菌是一种水源微生物，有水的地儿就可能有它的身影在。该菌广泛存在于自然界水源中，如土壤、灰尘、河水和沟渠中。在适宜环境中，如31~36℃水中可长期存活，在普通自来水中可存活400天以上。其还可存在于建筑物冷、热水管道系统中，在冷却水、空调冷凝水、医院用水及呼吸机等产生的气溶胶中曾被检出。军团菌还能与一些常见原虫、微生物形成共生关系，可寄生于阿米巴变形虫内而保持致病活力，因此在36~70℃热水中也能够存活。

军团菌是一种兼性细胞内寄生菌，在人类单核细胞和巨噬细胞内均能存活并繁殖。军团菌经呼吸道进入肺后，被中性粒细胞和巨噬细胞等吞噬细胞吞噬，释放出磷脂酶C(PLC)水解磷脂，干扰吞噬细胞膜。在吞噬细胞被裂解初期，细胞浆膜仍保存完好。吞噬细胞被感染一段时间后，含军团菌的细胞裂解释放出大量细菌，导致肺泡上皮和内皮急性损伤，并伴有肺水肿，可引起低氧血症和呼吸障碍[2]。此外，军团菌的致病性还与其产生的毒素有关。军团菌除具有其他革兰阴性杆菌所含有的脂多糖类内毒素外，还含有一种能溶解细胞的外毒素，细胞膜含有许多活性酶及使动物致死的毒素。军团菌是引起社区获得性肺炎(CAP)的常见病原菌。有文献指出，军团菌是引起CAP的第二或第三位常见病原体[3]。军团菌感染是CAP严重程度的独立危险因素[4]，其46.9％的患者在肺炎严重度评分(PSI)达到Ⅳ~Ⅴ级 [5]。军团菌肺炎病死率较高，据报道病死率为10％~33％[6,7]。

精准检测

军团菌的检测方法可参考以下标准：

✔ 国际标准:BS EN ISO11731:2017《水质量检测—军团菌检测及计数》

✔ 美国CDC 2005年颁布的《环境水军团菌分离培养程序》

✔ 中国行业标准WS195—2001《军团病诊断标准及处理原则》

细菌培养法

军团菌分离培养法的特异性为100％，是军团菌检测的“金标准”。

（一）标本处理

军团菌检测分为临床标本及环境水标本，不同的标本来源，样本的处理方法各不相同。

1、环境水样的处理程序：（美国CDC环境水样的处理程序）

采取水样，取约1000ml水样，加入Na2S2O3溶液0.5~1.0ml，中和水中可能存在的氯气和其他氧化性杀菌剂。

过滤浓缩：将水样摇均匀后，取500ml用装有0.45μm孔径滤膜的过滤器进行抽滤浓缩，加入5mlBCYEa肉汤至滤器，用三角形玻璃棒轻刮滤膜，尽量刮下膜上细菌，收集此浓缩液至一无菌试管。

酸处理：KCL-HCL(PH2.2)缓冲液，与样本1:1倍比例混合，室温放置10min。如水样杂菌含量多、水呈云雾状，可延长静置时间至15min。离心弃去上清液，再用等量的无菌蒸馏水进行洗涤。

热处理：50℃水浴30min进行热处理。

热敷育：将水样在37℃培养箱中放置3天后再进行处理。

2、临床样本处理

可采集患者痰液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液标本进行检测。肺泡灌洗液和胸腔积液经离心沉淀浓缩，痰液标本中加入等体积的 0.1％二硫苏糖醇(DTT)缓冲液，置于37℃水浴箱对痰液进行消化30～60min，有一些难以液化的痰液可提高消化温度到50℃再放置30min，待痰液液化后，离心弃上清液，加1 ml双蒸水洗涤1次，再次离心,弃去上清液，最终得到细菌混悬液样本。为了提高阳性率，也可对临床样本进行酸处理和热处理。

（二）接种培养

目前公认的最适宜培养基是缓冲活性炭酵母浸出液，加上铁、L半胱氨酸和a-酮戊二酸，称之为BCYEa培养基。并且有研究表明，在BCYFa培养基中添加合适的抗生素可有效抑制环境水样中的杂菌，提高嗜肺军团菌的分离[8]。

1、标本接种：将样本接种于军团菌选择性培养基BCYE—DGVPC。

2、培养：置于37℃、湿度80％、5％CO：孵箱中培养3-7天，每天观察生长情况。

3、典型的军团菌落呈圆形，扁平突起，边缘整齐。低倍镜下菌落中心为亮白色，质地粗糙，呈毛玻璃样结构，某些菌落边缘带蓝色、紫色、绿色或红色的自主荧光。将培养基上可疑菌落转接到阴性对照平板(血平板或不含I，半胱氨酸的BCYE平板)和BCYEa平板上，于37℃、5％C02孵箱中24～48 h，观察结果，血平板上不生长，BCYE平板上生长，革兰氏染色为革兰氏阴性杆菌,初步评定为军团菌。

SIFIC论坛莲雾老师、感控雏鹰老师帖子转摘

血清抗体检测

军团菌感染1周左右，血清中可检测出军团菌特异性IgM抗体；2周左右可检测到特异性IgG抗体。目前用于嗜肺军团菌血清抗体检测的常用方法有间接免疫荧光抗体检测(IFA)、微量凝集试验(MAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。

抗原试验

检测军团病患者尿液中存在的特异可溶性抗原，对嗜肺军团菌血清l型做出早期诊断,目前常用的是BinaxNOWR军团菌尿抗原检测试剂盒，经美国FDA批准，质量比较可靠，敏感度和特异度达95％，是一种较理想的诊断试剂方法简便，15 min内出结果，对早晚期疾病的检测都很方便。

检测水中军团菌抗原常用的是BinaxEquateTM试剂盒、Biotest EIA试剂盒该试剂盒及BartelsELISA试剂盒，均是专门用于检测水中Lp1。

核酸检测

军团菌分型常采用的方法有随机扩增多态性DNA(RAPD)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、扩增片段长度多态性(AFLP)和核酸测序分型(SBT)等技术。常见的有嗜肺军团菌(L．pneumophila，LP)、麦氏军团菌、博氏军团菌、菲氏军团菌、杜氏军团菌、长滩军团菌等，其中嗜肺军团菌是引起获得性肺炎的重要病原菌。

参考文献：

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[3]]Almirall J，Blanquer J，Bello S．Community-acquired pneumonia  among smokers[J]．Arch Bronconeumol，2014,50（6）：250-254.

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[9]SzyszMP,Pinkosz MC.Occurrence and pathogenicity of the family of Legionellaceae[J].Postepy Hig Med Dosw,2008,62(3): 337-353

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