人表面活性蛋白A(SP-A)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人表面活性蛋白A(SP-A)ELISA KIT用于测定血清，血浆及相关液体样本中表面活性蛋白A(SP-A)相关含量或活性。

原理：试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被表面活性蛋白A(SP-A)捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的表面活性蛋白A(SP-A)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人表面活性蛋白A(SP-A)ELISA KIT

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

操作步骤

1、取出试剂盒,室温(20-25℃)放置30分钟。

2、分组:取出96孔板,根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔,1个空白对照

3、标准品的稀释:准备小试管6只,依次编好号码,先在各小试管中加入标准品稀释液100ul,然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第三只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第四只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第五只试管中,充分混匀;然后在该试管中取100ul,弃掉。第六只试管作为0号标准品。

4、加样:依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中;空白对照孔加入50ul的蒸馏水;其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

5、温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

6、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒弃去,如此重复5次,拍干。

7、加酶标溶液:标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液(空白对照孔除外)。

8、温育:酶标板用封板纸密封后,放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。

9、洗板:用稀释后的洗涤液注满每孔,静置15-30s,充分清洗酶标板5次,用吸水纸彻底拍干。

10、显色:各孔加入显色剂A液50ul后,再加入显色剂B液50ul。

11、终止:25-37℃下避光反应10-15分钟,加入50ul终止液。

12、读板:在450nm波长读取各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于二烯丙基三硫对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠肺表面活性蛋白SP-A、SP-B mRNA表达的影响研究

选用LPS作为致伤剂复制小鼠ALI动物模型,从肺组织病理变化、肺湿/干重比以及SP-A、SP-B mRNA表达观察了DATS对LPS诱导ALI小鼠的预防作用,以期进一步为临床预防ALI/ARDS提供实验理论依据。方法:实验动物选择健康昆明小鼠共130只。

随机分为5组:（1）ALI组,每天腹腔注射与DATS等体积生理盐水一次,连续注射7天后,腹腔注射LPS 10mg/kg;

（2）DATS预防组,每天腹腔注射（2mg/ml）DATS 30mg/kg一次,连续注射7天后,腹腔注射LPS 10mg/kg;

（3）DATS治疗组,每天腹腔注射与DATS等体积生理盐水一次,连续注射7天后,腹腔注射LPS10mg/kg,之后30min再腹腔注射（2mg/ml）DATS 30mg/kg一次;

（4）DATS组,每天腹腔注射（2mg/ml）DATS 30mg/kg一次,连续注射7天;

（5）生理盐水对照组,每天腹腔注射与DATS等体积生理盐水一次,连续注射7天。各组动物（n=6）均按2h、6h两个时间点脱颈处死,测定各组肺组织湿/干重比值（wet/dry weight raito,W/D）,评估肺水肿程度。

用反转录PCR（reveuse transcription PCR,RT-PCR）检测各组肺组织SP-A、SP-B mRNA表达,并用Gel-pro凝胶分析软件对RT-PCR产物半定量分析。用SPSS12.0统计分析软件进行统计学分析,数据用均数±标准差（x±s）表示,多组均数比较行单因素方差分析（ANOVA）,两两比较用最小显著差法（least significant difference,LSD）;各两组均数比较行两个独立样本t检验（independent samples t Test）,P<0.05为有显著性差异。各组动物（n=2）注射LPS后12h,用HE染色（hematoxylin and eosin stain,HE stain）光镜下观察肺组织形态学改变。

结果:1肺W/D变化ALI组,2h时肺W/D较对照组无明显变化（P>0.05）,6h时肺W/D较对照组显著升高（P<0.05）,表明出现肺水肿。6h时,DATS预防组肺W/D与ALI组相比显著下降（P<0.05）,但DATS治疗组与ALI组相比肺W/D无明显改善（P>0.05）。单独注射DATS组与对照组无明显差异（P>0.05）。

2肺组织形态学变化肺大体观察,对照组及DATS组肺外观均无明显异常改变;ALI组肺体积增大,呈暗红色,散在有大小不一的红色斑点,切面疏松,有淡红色液体溢出;DATS预防组较ALI组病变明显减轻,但DATS治疗组较ALI组无明显变化。光镜观察肺组织形态学改变发现,对照组及DATS组肺组织结构完整,肺泡间隔无水肿,肺泡腔清晰;ALI组肺泡间隔增宽,腔内有少许出血、渗出及炎性细胞浸润,肺间质充血水肿,有大量炎性细胞浸润;DATS预防组肺组织中炎细胞浸润、渗出及出血等形态学变化较ALI组明显减轻;DATS治疗组无明显改善。

3肺组织SP-A、SP-B mRNA表达注射LPS后2h、6h,ALI组肺组织SP-A mRNA表达均明显低于对照组（P<0.05）;DATS预防组与ALI组相比,肺组织中SP-A mRNA表达均升高（P<0.05）,但仍低于对照组（P<0.05）;DATS治疗组肺组织SP-A、SP-B mRNA表达与ALI组相比均无明显差异（P>0.05）;DATS组肺组织SP-A、SP-B mRNA表达和相应的对照组相比较均无明显变化（P>0.05）。同组肺组织内SP-A、SP-B各自2h、6h mRNA表达相比较均无明显变化（P>0.05）。

参考文献

[1]Reactive Oxygen Species Inactivation of Surfactant Involves Structural and Functional Alterations to Surfactant Proteins SP-B and SP-C[J].Karina Rodríguez-Capote,Dahis Manzanares,Thomas Haines,Fred Possmayer.Biophysical Journal.2006(8)

[2]An aqueous extract of Platycodi radix inhibits LPS-induced NF-κB nucleartranslocation in human cultured airway epithelial cells[J].Jun-Hyuk Lee,Yung-Hyun Choi,Ho-Sung Kang,Byung-Tae Choi.International Journal of Molecular Medicine.2004(6)

[3]High-performance ion-pair chromatography method for simultaneous analysis of alliin,deoxyalliin,allicin and dipeptide precursors in garlic products using multiple mass spectrometry and UV detection[J].I Arnault,J.P Christidès,N Mandon,T Haffner,R Kahane,J Auger.Journal of Chromatography A.2003(1)

[4]Ventilator-induced heat shock protein 70 and cytokine mRNA expression in a model of lipopolysaccharide-induced lung inflammation[J].Harrit A.Vreugdenhil,Jack J.Haitsma,Koos J.Jansen,Jitske Zijlstra,Frans B.Pltz,Jaap E.van Dijk,Burkhard Lachmann,Hans van Vught,Cobi J.Heijnen.Intensive Care Medicine.2003(6)

[5]郭园园.二烯丙基三硫对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠肺表面活性蛋白SP-A、SP-B mRNA表达的影响[D].河北医科大学,2008.