植物脱落酸(ABA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物脱落酸(ABA)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法检测样本中植物激素脱落酸(ABA)的表达水平。

原理：往预先包被激素脱落酸（ABA）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的激素脱落酸（ABA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

植物脱落酸(ABA)ELISA试剂盒

样品收集、处理及保存方法

1.样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。

2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。

3.植物萃取液或其它相关样本：请1000x g离心20分钟，取上清即可检测。

保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于脱落酸和生长素调控香蕉及草莓果实成熟的作用机理研究

果实在成熟过程中受到多种激素调节,关于单一激素的调节已有很多报道,而多激素对果实成熟的互作研究较少,且机理仍不明确。因此本论文对香蕉（呼吸跃变型果实）及草莓（非呼吸跃变型果实）分别施加外源脱落酸（ABA）和生长素（IAA）,通过生理生化及分子生物学实验技术来阐释ABA和IAA对果实成熟的作用机制。

研究结果表明:1.以香蕉“巴西蕉”（Musa cuminate L.AAA group,cv.Brazilian）为实验材料,施加外源激素后对果皮进行DGE-seq分析。结果表明,ABA通过上调PaO、DXR、PSY、PME、PL基因的转录水平促进采后香蕉成熟,IAA通过下调PaO、DXR、PSY、PME、PL基因的转录水平抑制果实成熟。ABA+IAA处理通过平衡PaO、DXR、PSY基因的转录水平使果实颜色接近于对照组;ABA+IAA处理通过平衡PME和PL基因的转录水平使果实硬度与对照组相似。因此,在香蕉采后成熟过程中,ABA+IAA处理可能通过拮抗机制来抵消由ABA或IAA诱导的特定基因表达,从而抑制ABA或IAA单独发挥作用。

2. 以八倍体草莓“章姬”（Fragaria×ananas a Duch,cv.Akihime）为实验材料,对草莓施加不同激素。结果表明,ABA通过上调PAL、DFR、PME、PL基因的转录水平促进草莓成熟,IAA通过下调PAL、DFR、PME、PL基因的转录水平抑制果实成熟。ABA+IAA可能通过平衡PAL和DFRR基因表达,使草莓色泽变化保持平衡;ABA+IAA可能通过平衡果胶降解酶基因PME、PL,控制果实硬度,使果实硬度与对照组一致。在草莓成熟过程中,ABA+IAA处理可能通过拮抗机制来抵消由ABA或IAA诱导的特定基因表达,从而抑制ABA或IAA单独发挥作用。

3. 以草莓“章姬”为实验材料,克隆扩增得到两个MADS-box基因,FaMADS1和FaMADS2。系统进化树分析表明FaMADS1和FaMADS2分别属于SEP1/2和SEP3亚族。FaMADS1和FaMADS2时空表达测定表明,两个基因均只在花和果实中表达,且随着果实成熟表达量降低。FaMADS1和FaMADS2的瞬时超表达和沉默实验表明,FaMADS沿通过调控花青素合成相关基因（PAL、C4H、4CL、DFR、UFGT）、果实软化相关基因（PL、XTH）、香气物质相关基因（QR、A4T）的转录水平,进而改变果实成熟进程。FaMADS2通过调控下游软化相关基因（β-Gal、Xyl1）的转录水平,改变果实成熟过程中软化程度。

4. 草莓果实中FaMADS1和FaMADS2的表达受ABA与IAA的响应。启动子序列分析表明,FaMADS1和FaMADS2启动子中有ABA响应相关的顺式作用元件,通过酵母单杂交系统对ABA信号通路中的5个转录因子（ABI5-5、TRAB1、ABI5、ABI5-2、ABI5-3）进行筛选。

结果发现,ABA通过ABI5-5、TRAB1和ABI5调节FaMADS1基因表达,通过TRAB1、ABI5调节FaMADS2基因表达,进而调控果实成熟。

参考文献

[1]Global transcriptome profiling analysis of ethylene-auxin interaction during tomato fruit ripening[J].Jiayin Li,Xiaoya Tao,Jianwen Bu,Tiejin Ying,Linchun Mao,Zisheng Luo.Postharvest Biology and Technology.2017

[2]Precise protein post-translational modifications modulate ABI5 activity[J].Feifei Yu,Yaorong Wu,Qi Xie.Trends in Plant Science.2015(9)

[3]Genome-wide analysis of the MADS-box gene family in Brassica rapa（Chinese cabbage）[J].Weike Duan,Xiaoming Song,Tongkun Liu,Zhinan Huang,Jun Ren,Xilin Hou,Ying Li.Molecular Genetics and Genomics.2015(1)

[4]The pineapple AcMADS1 promoter confers high level expression in tomato and Arabidopsis flowering and fruiting tissues,but AcMADS1 does not complement the tomato LeMADS-RIN（rin）mutant[J].Richard L.Moyle,Jonni H.Koia,Julia Vrebalov,James Giovannoni,Jose R.Botella.Plant Molecular Biology.2014(4-5)

[5]卢文静.脱落酸和生长素调控香蕉及草莓果实成熟的作用机理[D].浙江大学,2018.