人肺腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人肺腺癌细胞该细胞是从一名25岁的白人男性肺腺癌患者的胸水中分离建立的；该患者曾使用过环磷酰胺、博来霉素、阿霉素进行治疗。该细胞接种至裸鼠可成瘤；可作转染宿主。

人肺腺癌细胞该细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

应用^[4][5]

用于MYG1在肺腺癌细胞中的作用和机制研究

研究MYG1在人肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）中的表达、作用及其潜在机制,为肺癌的治疗及预后提供新的思路。

方法:1、使用在线软件UALCAN首先分析了来自公共癌症数据库癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）的按照美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer,AJCC）分期的各期肺腺癌患者肿瘤组织及总肺腺癌患者与正常组织中MYG1的表达水平,并详细分析了不同MYG1表达水平与患者的发病年龄、性别、AJCC TNM分期、DLCO占预计值百分比、FEV1占预计值百分比、肿瘤组织生长的主要部位、是否出现淋巴结或远处转移、吸烟史及长期吸烟数量等临床肿瘤病理特征之间的相关性。

2、使用基于Kaplan-Meier的在线绘图工具分析该癌症数据库中MYG1表达与肺腺癌患者总体生存率（overall survival,OS）、首次进展（first progression,FP）和进展后生存率（post-progression survival,PPS）之间的相互关系,并通过使用Cox回归方法分别分析患者性别、临床分期、AJCC T分期、AJCC N分期、吸烟史及MYG1表达等多因素对这三者产生的影响。

3、通过基因富集分析（gene-set enrichment analysis,GESA）分析TCGA数据库肺腺癌表达数据集。用MYG1小干扰RNA或MYG1质粒转染A549和H1993细胞,在转染48h后通过细胞计数和平板克隆实验来检测转染后各组中不同MYG1表达水平对细胞增殖的影响,在转染24h后通过Transwell实验和伤口愈合实验检测转染后各组中不同MYG1表达水平对细胞迁移和侵袭的影响,在转染48h后通过蛋白免疫印迹（Western blot）实验分别检测MYG1蛋白、自噬相关标志物LC3及自噬相关标志物p62蛋白、p-AMPK蛋白及其总蛋白AMPK、p-p70 S6K蛋白及其总蛋白p70 S6K表达水平的变化,在转染48h后通过化学发光检测ATP活性。

结果:1、TCGA数据库中,相比于正常组织,MYG1表达在肺腺癌组织中显著性升高并且其二者之间的差异具有统计学意义（p<0.05）,此外,MYG1表达水平与AJCC分期N期在统计学上具有明显相关性（p<0.05）,与其他临床病理特征之间的表达差异不具有任何统计学意义（p>0.05）。

2、根据TCGA数据库中数据分析出的结果显示,MYG1表达与患者总体生存率和进展后生存率呈现负相关的关系并具有统计学意义（p<0.05）,与首次进展之间的差异则不具有统计学意义（p>0.05）。

3、GESA分析发现MYG1与氧化磷酸化和m TORC1信号通路有关,与阴性对照组相比,细胞计数和平板克隆实验发现MYG1过表达促进人肺腺癌A549和H1993细胞增殖,Transwell和伤口愈合实验结果显示MYG1过表达促进人肺腺癌A549和H1993细胞的迁移和侵袭,Western blot实验结果显示MYG1过表达LC3B-II/I蛋白比率降低、p62蛋白水平增高、p-AMPK/AMPK蛋白比率降低、p-S6K/S6K蛋白比率增高,MYG1敲低后结果则相反。

结论:MYG1可以通过调控AMPK/m TORC1信号传导通路促进A549和H1993细胞增殖、迁移和侵袭并抑制自噬,可能是肺腺癌潜在的治疗靶标。

参考文献

[1]A paradoxical role of reactive oxygen species in cancer signaling pathway:Physiology and pathology[J].Vaikundamoorthy Ramalingam,Rajendran Rajaram.Process Biochemistry.2021(prep)

[2]ATP-sensitive K+channel inhibition in rats decreases kidney and skeletal muscle blood flow without increasing sympathetic nerve discharge[J].Trenton D.Colburn,Clark T.Holdsworth,Jesse C.Craig,Daniel M.Hirai,Shawnee Montgomery,David C.Poole,Timothy I.Musch,Michael J.Kenney.Respiratory Physiology&Neurobiology.2020(prep)

[3]Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+channel explored with patch-clamp fluorometry.[J].Usher Samuel G,Ashcroft Frances M,Puljung Michael C.eLife.2020

[4]mTORC1 directly inhibits AMPK to promote cell proliferation under nutrient stress.[J].Ling Naomi X Y,Kaczmarek Adrian,Hoque Ashfaqul,Davie Elizabeth,Ngoei Kevin R W,Morrison Kaitlin R,Smiles William J,Forte Gabriella M,Wang Tingting,Lie Shervi,Dite Toby A,Langendorf Christopher G,Scott John W,Oakhill Jonathan S,Petersen Janni.Nature metabolism.2020(1)

[5]韩晓丹.MYG1在肺腺癌细胞中的作用和机制研究[D].桂林医学院,2021.