D407 人视网膜色素上皮细胞的应用

背景^[1-3]

D407人视网膜色素上皮细胞分离自视网膜组织；视网膜色素上皮（RPE）位于脉络膜和光感受器细胞外节之间，是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道；主要是由单层色素上皮细胞所构成，排列十分规则。人视网膜色素上皮参与视黄醇循环，吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性，并分泌多种生长因子，帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。细胞呈多角形，细胞分为三部分，即顶部、体部和基底部。

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D407人视网膜色素上皮细胞

细胞培养步骤:

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基(DMEM:GIBCO,货号12800017，添加NaHCO3 1.5g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于IL-33在β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞中的表达及作用机制研究

以IL-33作为主要研究对象，研究其在β-淀粉样蛋白（Aβ）刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性。2.初步探明IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制。

方法：1.IL-33在β-淀粉样蛋白刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性研究采用MTT法检测不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞后不同时间点的细胞存活率，观察其对视网膜色素上皮细胞损伤的影响。提取不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞24h后细胞RNA，采用定量PCR检测IL-33mRNA水平；收集细胞培养上清，ELISA检测IL-33蛋白表达；加入NF-κB，ERK1/2，JNK，p38MAPK信号通路抑制剂后，采用定量PCR及ELISA检测0.3μMAβ1-40刺激D407细胞24h后IL-33mRNA及蛋白水平表达，鉴定β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞后调控产生IL-33的信号通路。

2. IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制研究采用定量PCR检测不同浓度的IL-33刺激D407细胞16h后其受体ST2LmRNA表达情况，流式细胞术检测100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后细胞表面受体ST2L表达；不同浓度的IL-33刺激D407细胞16h后，收集细胞及培养上清，定量PCR和ELISA检测炎症因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-αmRNA和蛋白表达，探讨IL-33因子对D407细胞的作用机制；加入NF-κB，ERK1/2，JNK，p38MAPK信号通路抑制剂后，采用定量PCR及ELISA检测100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后上述炎症因子的表达，鉴定调控产生炎症因子的信号通路。

结果：1.IL-33在β-淀粉样蛋白刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性研究1.1 10.3μM Aβ1-40刺激组较正常组细胞形态变圆，胞体肿胀，细胞排列数量减少，细胞间间隙增加，且随Aβ1-40刺激浓度增加变化明显，而小于0.3μM Aβ1-40刺激组细胞形态无明显变化。MTT检测结果表明：随着Aβ1-40刺激浓度的增加，细胞存活率逐渐下降，除了0.001μMAβ1-40刺激组外，其余各刺激组与正常对照组相比细胞存活率均显著降低（P<0.05）。随着0.3μM和1μM Aβ1-40刺激D407细胞时间的延长，细胞存活率也逐渐下降，且与对照组相比均有显著性差异（P<0.05）。

1.2不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞后，IL-33mRNA及蛋白表达水平均增加，且在0.3μM刺激浓度时表达显著增加（P<0.05）。结果提示：Aβ1-40刺激D407细胞后能够引起IL-33表达上调。

1.3加入ERK1/2和p38MAPK信号通路抑制剂，0.3μM Aβ1-40刺激D407细胞24h后，IL-33mRNA表达水平显著降低（P<0.05），但只有加入ERK1/2信号通路抑制剂后，细胞培养上清IL-33蛋白水平才有明显下降（P<0.05）。结果提示：Aβ1-40刺激D407细胞后，IL-33的产生主要是通过ERK1/2信号通路调控，而p38MAPK信号通路仅参与了IL-33转录水平的调控。

3. IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制研究

2.1IL-33因子刺激D407细胞后，ST2L mRNA表达显著增加（P<0.05），并随着IL-33刺激浓度的增加而增加，且在100ng/ml IL-33刺激时表达量最高。采用流式细胞术检测D407细胞表面受体表达结果显示：D407细胞表面ST2L表达阳性，且在100ng/ml IL-33因子刺激细胞16h后表达上调。

2.2采用定量PCR及ELISA检测IL-33因子刺激D407细胞后炎症因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-αmRNA及蛋白水平表达。结果显示：20，50，100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后，炎症因子mRNA及蛋白水平表达均显著增加（P<0.05），且随着IL-33因子刺激浓度的增加，炎症因子表达均逐渐增加，并在100ng/mlIL-33刺激时表达量最高。结果提示：IL-33刺激D407细胞后IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α因子表达上调。

2.3加入NF-κB，ERK1/2，JNK，p38MAPK信号通路抑制剂，100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后，定量PCR和ELISA检测炎症因子mRNA及蛋白水平表达，结果显示：加入p38MAPK信号通路抑制剂后，IL-6表达显著下降；加入ERK1/2信号通路抑制剂后，IL-8表达显著下降；加入NF-κB信号通路抑制剂后，IL-1β表达显著下降；而加入JNK信号通路抑制剂后，TNF-α表达显著下降（P<0.05）。结果表明：IL-33因子刺激D407细胞后炎症因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α的产生是分别通过p38MAPK，ERK1/2，NF-κB以及JNK信号通路调控。

参考文献

[1]Tetrandrine suppresses amyloid-β-induced inflammatory cytokines by inhibiting NF-κB pathway in murine BV2 microglial cells[J].Fu Qian He,Bo Yun Qiu,Tian Ke Li,Qin Xie,De Jun Cui,Xiao Li Huang,Hua Tian Gan.International Immunopharmacology.2011(9)

[2]IL-33 exacerbates eosinophil-mediated airway inflammation.[J].Stolarski Bartosz,Kurowska-Stolarska Mariola,Kewin Peter,Xu Damo,Liew Foo Y.Journal of immunology（Baltimore,Md.:1950）.2010(6)

[3]Increased IL-33 expression by epithelial cells in bronchial asthma[J].David Préfontaine,Jessica Nadigel,Fazila Chouiali,Séverine Audusseau,Abdelhabib Semlali,Jamila Chakir,James G.Martin,Qutayba Hamid.The Journal of Allergy and Clinical Immunology.2010(3)

[4]IL-33 shifts macrophage polarization,promoting resistance against Pseudomonas aeruginosa keratitis.[J].Hazlett Linda D,McClellan Sharon A,Barrett Ronald P,Huang Xi,Zhang Yunfan,Wu Minhao,van Rooijen Nico,Szliter Elizabeth.Investigative ophthalmology&visual science.2010(3)

[5]刘晓萃.IL-33在β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞中的表达及作用机制研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2012.